一例雞尾鸚鵡鳥腸球菌感染的臨床報道

黃瀟航 ，王海論 ，彭佳佳，李詩藝，張 龍，賀金峪，王詩晨，黃志堅，殷光文

（1.福建農(nóng)林大學動物科學學院（蜂學學院），福州，350002；2.福建省動物藥物工程實驗室，福州，350002；3.福建省畜牧獸醫(yī)研究所，福州，350013）

雞尾鸚鵡（Nymphicus hollandicus）是一種中小型鸚鵡，成鳥尾羽修長，膽小機警，智商較高，可學人語，市場常見灰色、珍珠灰和黃色等觀賞品系。在我國江蘇、河南等地作為主要的鸚鵡繁育品種被飼養(yǎng)繁育，具有較高的觀賞和經(jīng)濟等價值。李順才等［1］總結了雞尾鸚鵡的人工養(yǎng)殖技術，指出近年該種類鸚鵡的繁育趨勢呈現(xiàn)普及化。作為觀賞鳥飼養(yǎng)，國內在該類鸚鵡的育雛等方面有較多的臨床累積資料，但在病毒等臨床防控方面，尤其是分子診斷方面的報道較少。鳥腸球菌（Enterococcus avium）是一種醫(yī)學臨床多見的致病菌，在肝、腦等膿腫病料中較為多見，其可與非腸鏈球菌（Streptococcussp.）［2］、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）［3］等發(fā)生混合感染。本研究就1 例急性、典型神經(jīng)癥狀，以死亡轉歸的雞尾鸚鵡雛鳥為研究對象，從臨床癥狀、病原微生物和組織病理學診斷等方面進行綜合報道，以期為國內動物園、養(yǎng)殖場等相關飼養(yǎng)繁育機構和養(yǎng)殖愛好者提供參考。

1 發(fā)病情況

家養(yǎng)觀賞雞尾鸚鵡品種為人工繁育的雞尾鸚鵡黃化品系，雌性，1 月齡，經(jīng)過長途運輸?shù)诌_飼主家中。前2 d 活潑好動，食欲正常，采用木盒飼養(yǎng)并使用加熱墊供暖。第2 天前夜加熱墊斷電停止供暖。第3 天出現(xiàn)精神萎靡、背羽凌亂、眼瞼腫大和站立無力等癥狀，糞便為黑綠色，泄殖腔處羽毛臟亂，出現(xiàn)脖頸強直扭曲等神經(jīng)癥候，最后呼吸減弱，體溫升高，最終死亡。經(jīng)飼主同意后剖檢。

2 實驗室檢查

2.1 寄生蟲檢查

采集死亡雞尾鸚鵡腸道內容物、糞便和黏膜刮片，以及肝、腎和肺等組織進行涂片和壓片檢查寄生蟲感染情況。

2.2 細菌分離鑒定

在無菌環(huán)境下采集死亡雞尾鸚鵡心、肝、脾和腎等病料，接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落生長。挑取菌落做肉湯培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)16 h 后，進行革蘭氏染色觀察、細菌生理生化鑒定和動物回歸試驗。根據(jù)試驗結果開展藥物敏感性試驗，共測試20 種常用抗生素：頭孢哌酮、多黏菌素B、四環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢曲松、萬古霉素、鏈霉素、哌拉西林、紅霉素、慶大霉素、青霉素、頭孢呋辛、阿米卡星、頭孢唑林、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、頭孢他啶、氨芐西林、林可霉素和卡那霉素。

2.3 動物回歸試驗

測定分離獲得的鳥腸球菌懸液OD600為0.685，攻毒接種于28 日齡的溫氏麻黃2 號雛雞（由福建農(nóng)林大學家禽孵化實驗室提供）。攻毒組（5羽）肌內注射0.8 mL 菌懸液，空白組（5 羽）肌內注射0.8 mL 滅菌氯化鈉溶液，同等條件飼養(yǎng)觀察7 d，記錄存活率，以評估該菌株的致病力。

2.4 病毒分離鑒定

采集部分臟器組織，無菌研磨破碎后，使用高壓滅菌生理鹽水按照1∶5 的比例制備懸浮液，使用組織提取試劑盒完成RNA 和DNA 的提取，設計合成特異性擴增引物進行樣本的RT-PCR 分子檢查。用于擴增新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）和雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）的引物序列（表1）。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，其中用于擴增CIAV 的引物根據(jù)參考文獻［4］合成，其余引物為自行設計合成。

表1 試驗用病毒檢測引物信息Tab.1 Primers information of virus detection in this study

2.5 病理組織學檢查

采集死亡雞尾鸚鵡和攻毒雛雞病變較為明顯的組織臟器，浸泡福爾馬林溶液后制備石蠟病理組織標本切片，采用蘇木精-伊紅染色（HE染色）。

3 結果

3.1 剖檢與寄生蟲檢查

死亡雞尾鸚鵡頭骨外觀可見出血點（圖1A），腦組織出血、液化。體腔剖檢發(fā)現(xiàn)心臟充血腫大，腺胃充血，肺和肝伴有出血，十二指腸和空腸可見出血，盲腸淤血，腎可見尿酸鹽沉積，其余臟器未見明顯異常（圖1B）。未見寄生蟲感染。

圖1 雞尾鸚鵡剖檢結果Fig.1 Skull and body cavity of the Nymphicus hollandicus

3.2 細菌分離鑒定

通過平板劃線培養(yǎng)24 h 后，在哥倫比亞血瓊脂平板上分離獲得具有金屬光澤和α溶血特性的菌落（圖2A）。通過對分離的單菌落進行革蘭氏染色，在油鏡下可觀察到成對短鏈狀的球菌，革蘭氏染色結果為陽性（圖2B）。

圖2 雞尾鸚鵡細菌分離鑒定結果Fig.2 Bacterial isolation and identification of Nymphicus hollandicus

生化試驗結果顯示：分離菌株能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，能利用乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇和木糖，七葉苷試驗為陽性（表2）。

表2 鳥腸球菌生化試驗結果Tab.2 Biochemical test results of Enterococcus avium

使用16S rRNA 通用引物對獲得細菌（命名為JWYW-01）的DNA 16S rRNA 進行PCR 擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳獲得陽性片段，長度約為1 600 bp（圖3），使用膠回收試劑盒回收DNA 片段，送往福州博尚生物技術有限公司測序。使用DNAStar 7.0 軟件對拼接基因進行同源性分析，通過與NCBI中的細菌同源性比對，下載多動物源分離株16S rRNA 序列，發(fā)現(xiàn)該分離株的16S rRNA 與Enterococcus avium（MT_604783.1）具 有99.8% 的同源 性。使 用MeAlign 軟件的鄰近樹法，重復測序計算1 000 次構建JWYW-01 的遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)該菌株與Enterococcus avium（MT_604783.1）聚于一支，與Enterococcus pseudoavium（NR_028705.1）和Enterococcus malodoratus（NR_042055.1）等腸球菌種形成明顯分支（圖4）。綜上，結合生理生化鑒定結果，本研究分離獲得的菌株為鳥腸球菌。

圖3 雞尾鸚鵡肝臟分離細菌的16S rRNA PCR產(chǎn)物Fig.3 16S rRNA PCR product of bacteria isolated from liver of Nymphicus hollandicus

圖4 雞尾鸚鵡肝臟分離細菌的16S rRNA基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene nucleotide sequence of bacteria collected from Nymphicus hollandicus liver

3.3 藥物敏感性試驗

采用抗生素測試試劑盒（常德比克曼生物科技有限公司生產(chǎn)）對頭孢哌酮和多黏菌素B 等20 種常用藥物進行敏感性試驗。測定抑菌圈大小并記錄（圖5）。

圖5 雞尾鸚鵡肝臟分離細菌的藥敏試驗結果Fig.5 Results of drug sensitivity test for the bacteria isolated from liver of Nymphicus hollandicus

藥物敏感性判斷參考唐云云等［5］的研究，當抑菌圈直徑＞15 mm時，為高度敏感；當抑菌圈直徑10～15 mm 時，為中度敏感；當抑菌圈直徑＜10 mm 時，為低度敏感。分離菌株對18 種常用抗生素表現(xiàn)為低度敏感，但對哌拉西林（PRL）和米諾環(huán)素（MIN）表現(xiàn)為中度敏感，說明PRL 和MIN 可用于鳥腸球菌的預防和發(fā)病早期的臨床治療。

3.4 動物回歸試驗

攻毒試驗結果顯示，鳥腸球菌對雛雞具有一定的致病性，致死率為20%，耐受過的雞群可恢復采食。發(fā)病雛雞臨床表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振，并伴有腹瀉等癥狀，與原病患雞尾鸚鵡臨床癥狀類似，剖檢可見胃腸道等多臟器出血（圖6）。從病死雛雞肝中可分離獲得類似形態(tài)的細菌。

圖6 雛雞攻毒后胃腸道和腦部病變Fig.6 Gastrointestinal and brain lesions in chicks after challenge

3.5 病毒分離鑒定

臨床樣本中均未檢出NDV、IBV和CIAV。

3.6 病理切片

病理切片顯示：雞尾鸚鵡肝臟出血較嚴重，出現(xiàn)局部炎性浸潤現(xiàn)象（圖7A），肺大量出血（圖7B），腦部神經(jīng)元固縮和壞死（圖7C），提示腦部神經(jīng)發(fā)生病變，胃充血（圖7D），十二指腸黏膜損傷嚴重（圖7E），其中基底層形態(tài)發(fā)生改變。使用分離菌株接種雛雞后，發(fā)現(xiàn)雛雞的肺和腎等組織臟器的臨床宏觀病變與死亡雞尾鸚鵡類似，肝大量出血（圖8A），肺出現(xiàn)嚴重出血（圖8B），腦部組織神經(jīng)元固縮并伴有出血征（圖8C），胃基底層出血（圖8D），十二指腸腸黏膜損傷嚴重，伴有炎性浸潤（圖8E）等，整體病理變化為出血。

圖7 雞尾鸚鵡病理組織檢查結果（HE ×200）Fig.7 Histological examination results of the Nymphicus hollandicus（HE ×200）

圖8 雛雞攻毒后的病理變化（HE ×200）Fig.8 Pathological changes in chicks after challenge（HE ×200）

綜合臨床癥狀、病原微生物鑒定和組織病理學結果，判斷鳥腸球菌感染是導致雞尾鸚鵡死亡的重要原因。

4 討論

鳥腸球菌是可導致腹膜炎［6］、髂腰肌膿腫和股骨頭骨髓炎菌血癥［7］、腦膿腫［8-9］及脾膿腫［10］等疾病的病原微生物，在食品安全和公共衛(wèi)生等領域由于其耐藥性［11-13］和隱蔽性等而被研究人員廣泛關注。國內外曾報道過豬源鳥腸球菌的臨床致病案例［5，14］，本研究報道了雞尾鸚鵡鳥腸球菌的致病案例，并通過雛雞回歸接種試驗，發(fā)現(xiàn)該株鳥腸球菌對禽類也具有一定的條件致病性。通過藥物敏感性試驗發(fā)現(xiàn)該菌株僅對20種常用抗生素中的哌拉西林（PRL）和米諾環(huán)素（MIN）2種藥物中度敏感。

對于本案例，筆者認為長途運輸應激和發(fā)病前夜供暖設施的停用是誘發(fā)雞尾鸚鵡疾病的主要原因。我國在虎皮鸚鵡（Melopsittacus undulatus）、牡丹鸚鵡（Agapornissp.）等常見觀賞鸚鵡種類的神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中，已經(jīng)報道了巴氏桿菌（Pasteurella）［15］等相關致病源，但尚未見鳥腸球菌感染誘發(fā)鸚鵡神經(jīng)疾病的相關報道。本研究是國內關于雞尾鸚鵡鳥腸球菌條件致病的臨床案例，從臨床癥狀、病原微生物和組織病理學診斷等多方面對該病進行了較為系統(tǒng)的介紹，旨在為相關飼養(yǎng)和繁育單位提供防治參考。