幼年大熊貓石膏樣小孢子菌性皮癬病的防治

陳 欣，黃文俊，王小蘭，李 碧，劉 禮，廖禮慧，文一帆，羅澤娟，吳 星，陳 敏，鄧 陶，代 莎，羅 娌

（成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，成都，610081）

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）作為我國保護生物學旗艦物種，獸醫學研究對其全生命周期健康管理起到至關重要的作用。皮膚癬菌病（dermatophytosis）作為一種大熊貓臨床獸醫學多發的感染性疾病，不僅會導致嚴重的皮損，還會影響大熊貓的生長發育，如處置不當易繼發二重感染威脅生命安全。目前已分離到可引起大熊貓皮膚癬菌病的病原有白色念珠菌（Candida albicans）［1］、須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes）［2］、枝孢樣枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）［3］和石膏 樣小孢子菌（Microsporum gypseum）［4］等，但關于流行病學、臨床特點和防治措施的報道較少。

近年來成都大熊貓繁育研究基地發生多例幼年大熊貓患皮膚癬菌病的案例，通過綜合運用臨床診斷方法確診為石膏樣小孢子菌感染，經藥敏試驗不斷調整優化防治措施，最終取得滿意效果。幼年大熊貓石膏樣小孢子菌性皮癬病是一種發病率高、病程長和傳染性強的皮膚癬菌病，為提高對該病的診斷準確性，縮短治療時間，提升治愈率，現將該病的流行病學、臨床特點、臨床診斷方法和防治措施總結如下，以供同行參考。

1 流行病學

石膏樣小孢子菌性皮癬病主要發生于幼年大熊貓（9～15 月齡），此月齡大熊貓正處于母乳采食量逐步減少階段。該病具有明顯的季節性，集中發生在高溫潮濕的夏秋兩季，此時天氣炎熱導致大熊貓外放時間減少，皮膚因缺乏陽光照射，且獸舍內環境中真菌數量激增，導致真菌孢子、菌絲和分泌的多種酶類對大熊貓的皮膚角質層、被毛具有極強的侵襲力［5］。此外，該病具有群發性特點，臨床上常見同一或臨近獸舍的幼年大熊貓群體性發病。由于引發皮癬菌病的真菌本身具有極強的生存能力，通過患獸之間的直接或間接接觸均易造成疾病傳播。

2 臨床特點

石膏樣小孢子菌性皮癬病引發的典型皮膚病變為出現一塊或多塊圓形、直徑為硬幣大小并快速擴展的脫毛皮膚表面癬斑，又稱“錢癬”（圖1）。常見癬斑處出現大量脫毛與大量白色陶土樣脫屑，局部炎癥刺激會導致水腫、丘疹和龜裂等皮膚損傷，并伴有瘙癢。上述皮膚癬斑好發于患獸的四肢、臀部等經常接觸地面容易被污染的身體部位。當患獸僅為局部性感染時，臨床癥狀以皮膚病變為主，血液指標一般無明顯異常，病程一般為14～28 d；當患獸繼發全身性感染時，除皮膚病變外，還會出現采食量下降、精神沉郁和體溫升高等臨床癥狀，血液指標常見白細胞計數、中性粒細胞百分比以及血沉等炎性指標急劇上升，病程多遷延不愈。

圖1 石膏樣小孢子菌性皮癬病典型的皮膚病變Fig.1 Typical skin lesions of dermatophytosis caused by Microsporum gypseum

3 臨床診斷

3.1 初步診斷

3.1.1 伍氏燈檢查

在暗室內使用波長為320～400 nm 的伍氏燈直接照射患病大熊貓皮膚癬斑處的皮膚、皮屑和毛發，檢查過程中均未觀察到明顯的熒光反應，但該檢查僅能作為初步篩查手段，無法準確判斷是否存在真菌感染。

3.1.2 直接鏡檢

用消毒后的手術刀片刮取患病大熊貓皮膚癬斑處的皮屑、毛發等病料，放置載玻片上，滴入10%KOH濕片檢查。鏡下觀察可見少量的成串小孢子和菌絲，初步判斷存在真菌感染，但無法確定菌種。

3.1.3 菌種分離培養與初步鑒定

采用鋼圈法真菌小培養［6］。首先將鋼圈固定于無菌載玻片上，再用無菌注射器經孔口注入融化的皮膚癬菌鑒定培養基（dermatophyte test medium，DTM）中，培養基約占鋼圈容量的一半，然后用消毒蓋玻片封閉鋼圈表面，最后用接種針將采集的病料接種于環內培養基上。25 ℃培養3 d，觀察發現有大量菌落生長（圖2A）。用乳酸棉酚藍染色后在鏡下觀察，可見呈紡錘形的大分生孢子，每個大分生孢子有4～6 個間隔，有少量結節狀菌絲（圖2B），初步判斷為石膏樣小孢子菌感染。

圖2 石膏樣小孢子菌的分離培養與鑒定Fig.2 Isolation，culture and identification of Microsporum gypseum

3.2 PCR測序鑒定

按照Ezup柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）說明書提取該菌株的DNA，使用真菌rDNA 內轉錄間隔區（ITS）序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行真菌ITS 擴增［7］，PCR 產物的后續序列測定由生工生物工程（成都）有限公司完成。將測序結果與GenBank中的核酸數據庫進行BLAST 比對分析，相似性最高的前10 位菌株均為石膏樣小孢子菌，覆蓋率為97%，相似度為100%，故確診該真菌為石膏樣小孢子菌。

3.3 藥敏試驗

采用紙片擴散法［8］，將菌種均勻涂布于沙氏瓊脂培養基（Sabourauds agar，SDA）中，待干燥后用無菌鑷子在培養基正中間貼上藥敏紙片，封口培養基并標記。培養基放置于真菌培養箱內28 ℃培養7 d，依據培養基上的抑菌圈直徑來判定藥物敏感程度。藥敏試驗顯示該真菌對咪唑類藥物、丙烯胺類藥物和三唑類藥物較敏感（表1）。

表1 石膏樣小孢子菌藥敏試驗結果Tab.1 The drug susceptibility result of Microsporum gypseum

4 防治措施

根據石膏樣小孢子菌感染的致病機理和幼年大熊貓的生物學特點，結合近年來對該病的臨床治療與跟蹤觀察，總結出綜合防治措施，不僅能縮短療程，使治愈率達到100%，并且極少發生并發癥。具體措施：（1）抗真菌治療。剃除病灶區毛發，清理皮屑、痂皮，患處及周圍皮膚先使用2%洗必泰清洗（2 次/d，連用14 d 以上），待干燥后涂抹萘替芬酮康唑乳膏（2 次/d，連用14 d 以上）。（2）抗細菌繼發感染。患處及周圍皮膚錯開抗真菌藥物使用時間，涂抹環丙沙星乳膏（2 次/d，連用14 d 以上），當患獸出現全身性感染時，可另增加口服頭孢泊肟酯片 ［5 mg/（kg·次-1），2 次/d，連用7 d］。（3）補充皮膚營養。口服復合維生素B（2 片/次，2 次/d，連用14 d 以上）。（4）隔離飼養并做好環境衛生消毒。隔離飼養發病大熊貓以防止交叉傳染，保證獸舍的日常衛生和通風干燥，同時確保能受到一定時間的陽光照射，定期使用聚維酮碘（濃度為5%，1∶400 倍稀釋）［9］、杜邦衛可（1∶100 倍稀釋）和84 消毒液（有效氯質量濃度500 mg/L）對獸舍噴灑消毒，交叉使用火焰噴槍對獸舍地面、墻面和獸欄進行火焰消毒。

5 討論

5.1 石膏樣小孢子菌性皮癬病對幼年大熊貓的致病性

石膏樣小孢子菌是親動物性和親土性皮膚癬菌，可引起人和多種動物感染，直接接觸是該菌的主要傳播途徑［5］。該菌感染人和動物的臨床表現多種多樣，在人［10］上可引發膿癬、體癬和白癬等，在犬［11］、小熊貓（Ailurus fulgens）［12］等動物上常可見黃癬樣皮損、膿性丘疹。對于大熊貓，臨床上該菌主要感染幼年大熊貓，主要引發圓形錢癬伴大面積皮膚損害，并發脫毛、皮屑和水腫等，若處置不及時易繼發細菌感染，嚴重個體甚至出現全身性炎癥反應。該菌針對幼年大熊貓的致病性強可能與以下因素相關：（1）幼年大熊貓皮脂腺發育尚不完善，皮脂分泌量較少，無法有效抑制真菌繁殖。因為皮脂不僅具有參與形成表皮脂質膜，維持表皮屏障的功能，而且其中的脂肪酸還具有抑制真菌活性的作用［13］。（2）幼年大熊貓免疫器官，如胸腺、脾臟和淋巴結等發育均尚不完善，機體處于低免疫力狀態時更易受皮膚癬菌感染，同時極低水平的免疫特性導致幼年大熊貓對母源抗體的依賴性極強［14］，這也是該病主要發生于幼年大熊貓母乳采食量逐步減少階段的原因。（3）石膏樣小孢子菌致病力較強，菌體除自身增殖、釋放毒素和變應原外，還能產生外分泌性蛋白酶使菌體更易于侵入角質引起皮膚炎癥的反應［10］。（4）高溫潮濕的夏秋兩季有利于真菌大量生長繁殖，此時幼年大熊貓群體性集中在室內獸舍飼養時間較長，一旦發病極易在群體間交叉傳染。

5.2 石膏樣小孢子菌性皮癬病臨床診斷的作用

皮膚癬菌病臨床表現多種多樣，依據患獸的流行病學、臨床癥狀僅能懷疑存在真菌感染，確診需要進一步的臨床診斷。臨床診斷中伍氏燈檢查方便快速，但熒光反應易受多種外界因素影響，故只能作為初步篩查手段。直接鏡檢和菌種鑒定培養是行之有效的傳統手段，但菌種形態受多種因素影響且變化大，也僅可進行初步判斷。分子生物學技術以特異性好、靈敏性高的優勢逐步應用于大熊貓皮膚癬菌病的診斷中。馬曉平等［3］、張悅天等［4］應用分子生物學技術分別確診枝孢樣枝孢霉和石膏樣小孢子菌可導致大熊貓皮膚癬菌病。

為明確近年來反復引發成都大熊貓繁育研究基地幼年大熊貓皮膚癬菌病的病因，在總結該病的流行病學、臨床特點的基礎上，綜合應用皮膚癬菌病臨床診斷方法，確定了石膏樣小孢子菌為其病原，并經藥敏試驗與臨床實踐篩選出局部外用萘替芬酮康唑等防治措施，最終取得滿意效果，可見規范細致的臨床診斷對皮膚癬菌病的科學用藥和預防具有指導意義。

5.3 石膏樣小孢子菌性皮癬病防治措施

石膏樣小孢子菌性皮癬病屬于淺部皮膚病原真菌引起的一類傳染性極強的人獸共患病。結合幼年大熊貓石膏樣小孢子菌性皮癬病臨床特點和藥敏試驗結果，選用萘替芬酮康唑作為抗真菌藥局部外用。萘替芬作為丙烯胺類藥物可選擇性地抑制角鯊烯環氧化酶的活性，從而抑制麥角固醇的合成；酮康唑作為咪唑類藥物可選擇性干擾細胞色素P-450 的活性，從而抑制麥角固醇的合成。兩者均可抑制真菌細胞膜麥角固醇的合成從而抑制真菌細胞的生長，合用時有協同作用，可增強抗菌活性，降低耐藥風險，提升局部皮膚的藥物濃度［15］。當患獸僅為局部性感染時，局部外用抗真菌藥物時長應持續14 d 以上，直至患處皮膚恢復，被毛生長且未有擴散跡象后再考慮停藥。抗真菌藥物的局部外用相比于口服藥物，對幼年動物的胃腸道、肝腎功能的副作用更小。當患獸已出現全身性感染時，還應通過口服或注射途徑給予抗生素類藥物防止炎癥進一步擴散，必要情況下，可考慮給予短期、小劑量的糖皮質激素以抗炎和免疫抑制［16］。

幼年大熊貓石膏樣小孢子菌性皮癬病主要發生于高溫潮濕的夏秋兩季，此時，作為親土性真菌的石膏樣小孢子菌不僅可以氣溶膠的形式存在于獸舍環境內，也可沉降附著在獸舍的地面、墻面和獸欄的表面。因此，一方面獸舍消毒防控應保證定期輪替使用多種消毒液噴灑消毒，并交叉進行火焰消毒；另一方面，針對幼年大熊貓（9～15 月齡）的飼養管理應注重保持動物體表與環境衛生，適時外放動物保證一定時間的光照，加強動物體況檢查尤其是皮毛觸診，一旦發現皮膚癬菌感染要立即采取隔離措施，這是切斷種群間交叉傳染的關鍵。