基于Illumina MiSeq的麋鹿糞樣菌群多樣性分析

李俊芳，白 冰，孟慶輝，程志斌，單云芳，劉 田，鐘震宇

（1.北京麋鹿生態(tài)實驗中心，北京，100076；2.北京市科學技術研究院資源環(huán)境研究所，北京，100089）

麋鹿（Elaphurus davidianus）是國家一級重點保護野生動物，曾在中國本土滅絕［1］。自1985 年從英國重引入以來，已建立80 余處遷地保護地，總數(shù)量近12 000 只。經(jīng)種群調查發(fā)現(xiàn)，遷地保護麋鹿存在繁殖障礙和死亡率高等問題，個別種群發(fā)展難以維持［2-3］，消化系統(tǒng)疾病是導致麋鹿大量死亡的最主要原因，主要表現(xiàn)為由產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）等引起的出血性腸炎。1995—2009 年，每年都有出血性腸炎等消化系統(tǒng)疾病導致麋鹿死亡的報道［2］，因此，有必要對麋鹿消化道疾病進行深入研究，而了解麋鹿胃腸道菌群的結構和組成是研究的前提。

動物腸道菌群形成一個龐大而復雜的微生態(tài)平衡系統(tǒng)，在維持胃腸道健康方面起著重要作用［4］。近年來，對野生動物腸道微生態(tài)的研究得到了廣泛關注［5］。腸道細菌大多不可培養(yǎng)，常規(guī)方法無法全面檢測菌群組成，需用測序技術研究麋鹿消化道正常菌群分布。本研究應用Illumina MiSeq 對石首麋鹿國家級自然保護區(qū)、遼寧遼陽千山鹿場、北京麋鹿生態(tài)實驗中心和河北灤河上游國家級自然保護區(qū)的32 只麋鹿糞便菌群多樣性進行全面檢測，旨在為今后麋鹿消化道疾病的研究提供有價值的基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

32 只麋鹿（表1）均為正常健康個體，各采集新鮮糞便20 g，快速放入自封袋內，轉至液氮速凍，置-80 ℃保存。北京麋鹿生態(tài)實驗中心（MLY）12 份樣品，河北灤河上游國家級自然保護區(qū)（MLWC）6份樣品，遼寧遼陽千山鹿場（LY）12 份樣品，石首麋鹿國家級自然保護區(qū)（SS）2 份樣品，其中MLY-12 為1 月齡麋鹿糞便樣品，其余為成年麋鹿糞便樣品。

表1 麋鹿糞便樣本信息Tab.1 Information of feces samples of Père David’s deer

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌總DNA提取

每份樣本取200 mg，使用糞便基因提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取細菌總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度。

1.2.2 Illumina MiSeq測序流程

細菌基因組文庫構建及測序均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。具體操作步驟如下：合格的DNA 片段經(jīng)電泳回收后，在Illumina MiSeq 測序平臺上，使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA 基因V3—V4 可變區(qū)進行PCR 擴增（PCR儀：ABI GeneAmp?9700 型）。擴增程序：95 ℃預變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后4 ℃保存。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后，使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）回收產(chǎn)物純化，并用Quantus? Fluorometer（Promega，USA）對回收產(chǎn)物檢測定量。使用NEXTflexTMRapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美國）建庫。構建好的文庫利用Illumina 公司的MiSeq PE300 平臺測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Barcode 將數(shù)據(jù)分揀后拼接成Tag。利用QIIME軟件對原始測序數(shù)據(jù)初篩，保留長度在200 bp左右的序列，將Barcode 序列和引物序列同時去除，用Mothur 軟件將序列合并，去掉干擾數(shù)據(jù)，用uclust和furthest 對樣品的有效序列進行聚類，以97%的一致性聚類為特征序列（OTUs），挑選每個OTU 中豐度最高的序列與Greengenes比對，再用FastTree法進行多序列比對，構建OTU表。在QIIME中，將嵌合體和Singletons 去除，計算樣品序列及OTU 數(shù)，在界、門、綱、目、科、屬和種水平上進行物種注釋，并繪制各樣品在門水平上物種組成的柱狀圖，運用去除嵌合體和Singletons 后的OTU 表，計算菌群多樣性及豐度指數(shù)，并繪制稀釋曲線，結合樣本的OTU 種類及豐度，計算樣品間的加權UniFrac 矩陣，利用非加權組聚類法UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）在MEGA 5.0 軟件中，對樣品的共享菌群進行聚類分析，用R 軟件生成相應的聚類熱圖（heatmap）和主成分分析（PCA）圖，同時計算Alpha多樣性指數(shù)，包括香農-維納指數(shù)（Shannon-Wiener index）及辛普森指數(shù)（Simpson index）。

2 結果

2.1 各樣品序列及OTU

共檢測麋鹿糞便樣本32個，得到1 438 677條有效序列，平均每個樣品為（44 959±12 348）條序列，其中MLY-4 含有效序列最多，為68 077 條，LY-2 含有效序列最少，為29 573條。序列拼接優(yōu)化后，按相似度大于97%的標準對有效序列進行OTU 聚類，共獲得31 459個物種分類的OTUs，平均每個樣品OTU個數(shù)為（983±240）（表2）。樣品質控后的序列長度為420～460 bp（圖1）。

圖1 麋鹿糞便樣品質控后的序列長度Fig.1 Sequence length distribution of fecal samples of Père David’s deer after quality control

表2 測序序列和OTU數(shù)量統(tǒng)計結果Tab.2 Statistical results of sequencing and OTU quantity

2.2 樣品OTU稀釋曲線

從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的個體，以個體數(shù)與物種數(shù)建模，比較不同樣本中菌群的豐富度。圖2顯示，抽取樣品的稀釋曲線趨于平緩，表示該試驗結果較好地覆蓋了大部分菌群。

圖2 腸道菌群豐富度稀釋曲線Fig.2 Richness rarefaction curve of get microbiota

2.3 Shannon-Wiener曲線

根據(jù)樣本測序量在不同測序深度構建Shannon-Wiener 指數(shù)曲線。圖3 中Shannon-Wiener 曲線已經(jīng)進入平臺期，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映本試驗需要的絕大多數(shù)的微生物信息。

圖3 腸道菌群Shannon-Wiener稀釋曲線Fig.3 Shannon-Wiener index rarefaction curve of get microbiota

2.4 核心菌群結構及組成分析

用QIIME 軟件對樣品不同分類水平進行物種注釋，對菌群結構進行詳細的分類整理，共獲得12 個門，74個屬。

在門水平上，物種注釋共獲得11 個門和1 個未分類的門，檢測到的99.7%微生物群落為細菌，未標記的微生物僅占0.3%。優(yōu)勢菌群（相對豐度大于1%）從高到低分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）、放線菌門（Actinobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、梭桿菌門（Fusobacteria）和其他（others），其中擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌群。圖4 顯示，不同樣品的菌群門類基本相同，但是組成比例不同，同一菌門的相對豐度差異較大。

圖4 麋鹿腸道菌群在門水平上的物種相對豐度Fig.4 Species relative abundance of gut microbiota in Père David’s deer at the phylum level

在屬水平上，共獲得74 個屬，其中27 個（36.5%）尚未被注釋出屬名。優(yōu)勢菌屬（相對豐度大于1%）一共有15 種，占89%，從高到低分別為瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、假單胞菌屬（Pseudomonas）；而雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和乳桿菌屬（Lactobacillus）檢測的相對豐度低，在MLY-12 糞便樣品中卻是優(yōu)勢菌屬。

2.5 樣品間共享菌群分析

運用Heatmap 將樣本間豐度相似性進行聚類，得到共享菌群分析圖（圖5），其中MLY-12樣本的細菌群落組成與其他樣本明顯不同，LY-12 的菌群組成與其他樣本的差異性也較大。

圖5 樣品間共享菌群分析Fig.5 Analysis of shared microbiota between samples

2.6 主成分分析

將不同樣本OTU（97%相似性）主成分組成的差異反映在二維坐標圖上（圖6）。所有樣品被分為3部分，其中SS 的2 個樣品單獨聚在一起，LY 的大部分樣品聚在一起，而MLY、MLWC 和部分LY 系列樣品聚在一起。

圖6 麋鹿糞便樣品微生物主成分分析Fig.6 Principal component analysis（PCA）in the fecal sample of Père David’s deer

2.7 菌群多樣性

樣品的多樣性結果見表3。群體內香農-維納指數(shù)為2.42～5.83，其中MLY-12 最低，LY-3 最高。辛普森指數(shù)為0.007 3～0.148 6，最高為MLY-12（0.148 6），最低為MLY-4（0.007 3）。

表3 樣品間的Alpha多樣性Tab.3 Alpha diversity index of between samples

3 討論

本研究利用Illumina MiSeq測序檢測了4個麋鹿棲息地的32 只麋鹿糞樣微生物菌群多樣性，獲得了較全面的菌群信息。Shannon-Wiener 曲線已經(jīng)進入平臺期，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可覆蓋32 只麋鹿的腸道微生物，能真實全面地反映正常腸道菌群組成。

OTU 聚類后共檢測出11個門和1個未分類的門類，麋鹿腸道微生物主要來自擬桿菌門和厚壁菌門，這與前人對瘤胃微生物的研究結果［6-10］一致，Sundset 等［9-10］對挪威地區(qū)馴鹿（Rangifer tarandus）瘤胃微生物區(qū)系的研究表明，馴鹿瘤胃內細菌主要由擬桿菌門和厚壁菌門細菌組成。麋鹿和其他有蹄類動物糞便中的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和擬桿菌門，可能是因為它們以粗飼料為食［11］，胃腸道中的擬桿菌和厚壁菌在粗纖維的消化過程中發(fā)揮著重要作用［12］。在屬水平上還有大量尚未命名的菌屬，這與目前麋鹿微生物的研究水平有限有關，隨著測序水平的不斷進步，未來將會檢測認知更多的菌屬。

樣品OTUs 的豐度顯示MLY-12 的菌群豐度最低，樣品間共享菌群的分析也顯示MLY-12 與其他樣品的共享菌群最少，同時其香農-維納指數(shù)也最低。該樣品采集于麋鹿中心1 只人工喂養(yǎng)的1 月齡麋鹿，研究結果表明1 月齡麋鹿與成年麋鹿的腸道菌群存在很大的差異，這個結果也有待進一步分析。

主成分分析中，所有糞便樣品被分為3 部分，其中，石首麋鹿國家級自然保護區(qū)采集的糞便樣品、大部分遼寧遼陽千山鹿場采集的糞便樣品分別聚在一起，而北京麋鹿生態(tài)實驗中心、河北灤河上游國家級自然保護區(qū)和部分遼寧遼陽千山鹿場糞便樣品聚在一起。這可能與遷地保護時間長短有關（表1），遷地后，隨著采食條件的不同，遷地的麋鹿腸道菌群有了進一步的分化。北京麋鹿生態(tài)實驗中心自1985 年成立以來，致力于擴大麋鹿繁育種群及建立遷地種群，迄今麋鹿中心建立的麋鹿遷地保護場所占我國總麋鹿保護場所的71.74%，成為我國麋鹿種群恢復和遷地保護的主要技術支撐單位，發(fā)揮著舉足輕重的作用。本研究采集了石首麋鹿國家級自然保護區(qū)、遼寧遼陽千山鹿場、河北灤河上游國家級自然保護區(qū)的麋鹿糞樣，聚類分析結果表明，隨著遷地時間縮短，聚類結果越集中。河北灤河上游國家級自然保護區(qū)于2016年重引入麋鹿10只，麋鹿群體形成時間較短，腸道菌群改變尚不明顯，因此，河北灤河上游國家級自然保護區(qū)與麋鹿中心麋鹿糞便菌群聚類在一起，而湖北石首麋鹿種群形成時間最長，腸道菌群分化最明顯，與其他樣品的分離距離最遠，區(qū)分也最明顯。

4 小結

本研究應用Illumina MiSeq 對4 個麋鹿棲息地32 只麋鹿糞便樣本的菌群多樣性進行分析，共檢測出1 438 677 條有效序列，平均每個樣品有（44 959±12 348）條有效序列；在97%相似度條件下共獲得31 459 個物種分類的OTUs，平均每個樣品為（983±240）個OTUs；平均讀長為426 bp。

在門的分級水平上，糞便細菌主要來自11 個門，其中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。不同遷地間麋鹿糞樣細菌多樣性存在差異。聚類結果可將糞便樣品聚為3 個群落，隨麋鹿遷出時間的延長，麋鹿腸道菌群聚類分析的遠近越明顯，這可能與遷出地的麋鹿取食改變有關。