新疆阿克蘇地區豬源糞腸球菌耐藥性分析及相關耐藥基因的檢測

王 東,易海波,李宏博,秦 蕾,徐琦琦,吳慧敏,夏利寧

(1.新疆農業大學動物醫學學院,烏魯木齊 830052;2.新疆昭蘇縣喀夏加爾鎮畜牧獸醫站,新疆昭蘇 835618)

0 引 言

【研究意義】腸球菌屬于人和動物的正常腸道共棲菌,但是在特定的情況下也會引起諸如尿道感染、菌血癥、腦膜炎等重要感染,嚴重時會導致死亡[1]。目前臨床腸球菌感染大部是由糞腸球菌和屎腸球菌引起的,占比達到85%～95%[2]。腸球菌屬于醫院感染的重要病原菌之一[3],腸球菌作為生豬體內的常在菌,對當地豬源糞腸球菌的進行耐藥監測,可以預測當地耐藥情況,防止病原菌通過食物鏈傳播。【前人研究進展】腸球菌不僅對頭孢菌素類、磺胺類、低濃度的氨基糖苷類與林可胺類藥物存在固有耐藥[4],還能夠捕獲外源耐藥基因使自身獲得性耐藥[5],增加了臨床治療腸球菌感染的難度。【本研究切入點】腸球菌在耐藥性傳播的問題上往往擔任著耐藥基因“儲存庫”的角色,不僅具有將自身攜帶的耐藥基因通過水平轉移的方式傳遞其他細菌的能力[6],還能通過食物鏈在人和動物之間傳播[7]。目前新疆關于糞腸球菌耐藥性及相關耐藥基因研究的報道較少。需進行新疆阿克蘇地區豬源糞腸球菌耐藥性分析及相關耐藥基因的檢測。【擬解決關鍵問題】以阿克蘇地區三個豬場的豬源糞腸球菌為研究對象,分析阿克蘇地區豬源糞腸球菌的耐藥數據,為養殖場制定合理用藥方案提供數據支撐,為該地區的耐藥性監測提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源

2018年11月在阿克蘇地區A、B、C三個豬場的豬只肛拭子采集樣本。

1.1.2 菌株及培養基

糞腸球菌標準質控菌株(ATCC29212)、金黃色葡萄球菌標準質控菌株(ATCC29213)購自杭州天和微生物試劑有限公司;腸球菌選擇培養基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)、腦心浸肉湯(BHI)、MH肉湯(MHB)培養基均購自北京奧博星有限公司。

1.1.3 藥 品

大環內酯類:紅霉素、泰樂菌素;噁唑烷酮類:利奈唑胺;四環素類:四環素、多西環素;糖肽類:萬古霉素;酰氨醇類:氟苯尼考;喹諾酮類:左氧氟沙星、恩諾沙星;氨基糖苷類:慶大霉素;截短側耳素類:沃尼妙林;以上藥物均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 腸球菌的分離鑒定

通過滅菌棉簽采集豬直腸糞樣后置于經過滅菌的裝有1 mL MH肉湯的2 mL規格的EP管中,采集后的樣品置于4 ℃冰箱中保存,完全采集完畢后,通過將樣品置于含有低溫冰袋的泡沫箱后運回。

將帶有滅菌肉湯的肛拭子置于恒溫搖床中37 ℃,180 r/min過夜培養增菌;接取5 μL菌液于含6.5% NaCl的BHI肉湯中置于恒溫搖床中42 ℃,180 r/min,培養16～18 h,使用接種環蘸取一環菌液劃線涂布與腸球菌選擇培養基上,倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。挑取平板上大小適中、白色圓滑凸起且菌落周圍顯示黑色的單菌落,初步鑒定為腸球菌,挑取單菌落至滅菌BHI培養基中,恒溫搖床42 ℃,180 r/min過夜培養保藏至-20 ℃冰箱備用。

使用水煮法[8]提取疑似菌株DNA模板,根據文獻[9]序列合成糞腸球菌持家基因引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用PCR的方法鑒定糞腸球菌,并將疑似菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行16S測序進行鑒定。 表1

表1 腸球菌鑒定引物序列

1.2.2 藥物敏感性

根據美國臨床實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)發布的抗微生物抗菌藥物敏感性試驗的標準[10, 11],對分離的糞腸球菌進行8大類12種藥物的最小抑菌濃度測定(MIC),采用糞腸球菌標準菌株ATCC29212、測試菌株結果以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)表示。

1.2.3 相關耐藥基因測定

根據文獻[12, 13],合成相關耐藥基因引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,使用PCR方法檢測糞腸球菌的耐藥基因。表2

1.3 數據處理

使用IBM SPSS Statistics 26.0進行數據分析,對藥敏結果以及多重耐藥結果使用卡方或Fisher精確檢驗進行非參數檢驗,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 三個豬場豬源糞腸球菌分離情況

研究表明,從阿克蘇地區三個豬場共采集樣品624份,A、B、C三個豬場采集的樣品數依次為269份、234份、121份,共分離糞腸球菌160株,總體分離率為25.6%,A、B、C豬場分離糞腸球菌數依次為44株、81株、35株,其分離率依次為16.4%、34.6%、28.9%。表3

表2 相關耐藥基因引物序列

表3 阿克蘇地區三個豬場豬源糞腸球菌分離

2.2 阿克蘇地區三個豬場豬源腸球菌的耐藥變化

研究表明,B豬場對所檢12種藥物的耐藥菌株分離率顯著高于A和C豬場(P<0.05),A、C兩個豬場之間差異不顯著(P>0.05),三個豬場對紅霉素、泰樂菌素、四環素、多西環素、慶大霉素和沃尼妙林的耐藥率均達到90%以上,其中對利奈唑胺、氟苯尼考、左氧氟沙星及恩諾沙星的耐藥率分別為21.3%、30.6%、53.8%和57.5%。B豬場糞腸球菌分離株對這幾種藥物的耐藥率顯著高于A、C兩個豬場(P<0.05);A豬場糞腸球菌分離株對恩諾沙星及氟苯尼考的耐藥率顯著高于C豬場(P<0.05);其余藥物A、B、C豬場糞腸球菌分離株的耐藥率之間差異不顯著(P>0.05)。表4

2.3 阿克蘇地區3個豬場豬源糞腸球菌的多藥耐藥變化

研究表明,A豬場的耐藥譜型在4～9耐之間,以6耐和7耐為主,占比70.4%;B豬場的耐藥譜型在7～10耐,以8耐和10耐為主,占比為81.4%;C豬場的耐藥譜型在3～8耐,以6耐為主,占比為80.0%。B豬場在8、9以及10耐的菌株占比顯著高于其余兩個豬場(P<0.05);C豬場6耐菌株占比顯著高于A和B豬場(P<0.05)。三個豬場豬源糞腸球菌的耐藥嚴重程度依次為B豬場、A豬場、C豬場。表5

表4 阿克蘇地區三個豬場豬源腸球菌的耐藥變化

表5 阿克蘇地區3個豬場豬源糞腸球菌的多藥耐藥變化

2.4 豬源糞腸球菌耐藥基因檢出情況

研究表明,阿克蘇地區三個豬場的豬源糞腸球菌均檢出ermB、ermC、tet(K)、tet(L)、tet(M)、aac(6')/aph(2")、lsa(E)基因,其中ermB基因在A、B、C三個豬場的檢出率依次為90.9%(40/44)、100(81/81)、94.29%(33/35),ermC基因在A、B、C三個豬場的檢出率依次為70.5%(31/44)、51.9%(42/81)、80.0%(28/35),tet(K)基因在A、B、C三個豬場的檢出率依次為95.5%(42/44)、74.1%(60/81)、68.6%(24/35),tet(L)基因在A、B、C三個豬場的檢出率依次為97.7%(43/44)、86.4%(70/81)、77.1%(27/35),tet(M)基因在A、B、C三個豬場的檢出率均為100.0%,aac(6')/aph(2")基因在A、B、C三個豬場的檢出率依次為29.6%(13/44)、79.0%(64/81)、25.7%(9/35),lsa(E)基因在A、B、C三個豬場的檢出率依次為15.9%(7/44)、60.5%(49/81)、22.7%(8/35);ermA、fexA、optrA基因僅在A和B兩個豬場檢出,其中ermA在A、B兩個豬場的檢出率分別為15.9%(7/44)和37.0%(30/81),fexA在A、B兩個豬場的檢出率分別為15.9%(7/44)和51.9%(42/81),optrA基因檢A、B兩個豬場的檢出率分別為15.9%(7/44)和45.68%(37/81);fexB基因僅在B豬場檢出,檢出率為1.23%(1/81);三個豬場均未檢出多藥耐藥基因cfr。圖1

圖1 豬源糞腸球菌耐藥基因檢出情況Fig. 1 Situation of detection of drug resistance genes of Enterococcus faecalis from pigs

3 討 論

3.1隨著抗菌藥物在養殖業的不斷使用,細菌耐藥性的問題開始逐漸顯現出來[14,15]。目前多個國家和地區的抗生素監測系統已將腸球菌作為耐藥性監測的指示菌[16]。

分離結果顯示:研究在阿克蘇地區部分豬場分離的糞腸球菌總體分離率為25.6%,低于董鵬[17]在河南地區所分的豬源糞腸球菌的分離率(51.3%),可能地域不同、采樣時間不同等因素導致的。

3.2藥敏結果顯示:阿克蘇地區不同豬場對紅霉素、泰樂菌素、四環素、多西環素、慶大霉素和沃尼妙林的耐藥率高達90%以上,耐藥結果與顧欣[18]和姚曉慧[19]報道的結果相近,以上藥物的高耐藥率表明以上6種藥物對豬源糞腸球菌感染的治療效果可能不理想,三個豬場對氟苯尼考、左氧氟沙星以及恩諾沙星的耐藥率的差異也說明阿克蘇地區各養豬場之間用藥管理水平參差不齊。

3.3多藥耐藥結果顯示:研究中阿克蘇地區豬源糞腸球菌的多藥耐藥主要集中在6耐及以上,B豬場主要耐藥譜型集中在8～10耐,表明阿克蘇地區部分豬場的豬源糞腸球菌的耐藥性問題應當得到重視,而A和C兩個豬場的耐藥形勢也應引起足夠的重視,lsa(E)基因可以介導包括鏈陽霉素A類、林可霉素類、截短側耳素類藥物在內的多種抗菌藥物耐藥[20],optrA基因可以介導噁唑烷酮類及酰氨醇類藥物耐藥[22],兩種基因均可通過水平傳播被其他細菌捕獲,從而獲得性耐藥。研究lsa(E)基因檢出率達40.0%,optrA基因檢出率達25.6%,并且研究中攜帶optrA基因的糞腸球菌已經表現出噁唑烷酮類藥物利奈唑胺低水平耐藥的現象,鏈陽菌素A類和噁唑烷酮類藥物在治療耐萬古霉素腸球菌(Vancomycin-ResistantEnterococcus, VRE)及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)感染時存在藥物有效性下降的可能[21-23]。

4 結 論

共分離糞腸球菌160株,總體分離率為25.6%,其分離率依次為16.4%、34.6%、28.9%。B豬場對所檢12種藥物的耐藥菌株分離率顯著高于A和C豬場(P<0.05),A、C兩個豬場之間差異不顯著(P>0.05),A豬場的耐藥譜型在4～9耐,以6耐和7耐為主,占比70.4%;B豬場的耐藥譜型在7～10耐,以8耐和10耐為主,占比為81.4%;C豬場的耐藥譜型在3～8耐,以6耐為主,占比為80.0%。阿克蘇地區三個豬場的豬源糞腸球菌均檢出ermB、ermC、tet(K)、tet(L)、tet(M)、aac(6')/aph(2")、lsa(E)基因。