馬鈴薯病毒病病原RT-PCR分子鑒定

楊茹薇,劉 易,李江濤,古麗米拉·熱合木土拉,羅正乾,徐琳黎,沈洪飛

(新疆農業科學院綜合試驗場,烏魯木齊 830012)

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosumL)是茄科茄屬的一年生草本塊莖植物,其塊莖可供食用[1]。馬鈴薯是糧食、蔬菜兼用作物,在動物飼料工業釀酒、提取淀粉、種薯及各種加工產品中應用廣泛。目前世界上馬鈴薯的種植面積和產量僅次于小麥、水稻和玉米,在糧食作物中位居第4。馬鈴薯病毒病是影響馬鈴薯生產的主要病害之一,在世界各國馬鈴薯種植區均有分布,其流行較廣,危害性較大,導致馬鈴薯的產量下降和質量變劣,一般可減產20%～50%,嚴重時減產可達80%以上[2]。蚜蟲傳播、接觸傳播和摩擦傳播是馬鈴薯病毒病的主要傳播途徑[3、4]。【前人研究進展】Zang等[5]利用酶聯免疫吸附原理結合傳感器介紹了檢測煙草花葉病毒的新方法。多重RT-PCR在病毒檢測中得到了廣泛的推廣和應用[6]。Feng等[7]運用實時定量PCR技術檢測出黃瓜花葉病毒,并建立了方程進行數據分析。聶峰杰等[8]應用RT-PCR技術對寧夏馬鈴薯脫毒種薯進行了病毒檢測。沈林林等[9]采用多基因聯合方法對福清產區馬鈴薯Y病毒株系組成進行鑒定。【本研究切入點】目前,我國內蒙古、黑龍江、山東等地已有馬鈴薯病毒病分子鑒定的報道[10-18]。需應用RT-PCR分子鑒定技術進行馬鈴薯病毒病病原種類的鑒定,分析我國新疆馬鈴薯主產區病毒病害的發生情況。【擬解決的關鍵問題】采集我國新疆主產區馬鈴薯病毒樣本,完成陽性樣本的序列比對及分析,為有針對性綜合防控我國新疆主產區病毒病提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2021年在我國新疆馬鈴薯主產區烏魯木齊縣、吉木薩爾縣、奇臺縣、巴里坤縣、澤普縣,共87份樣本,對其編號后放置于-80℃冰箱保存備用。表1

表1 病毒病采樣點

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及RT-PCR檢測

按照提取試劑盒將馬鈴薯葉片RNA提取后,將總RNA反轉合成為cDNA,以cDNA為模板進行病毒的RT-PCR檢測。PCR 反應體系均為:2×easyTaqsuper Mix 10 μL、正反向引物各0.5 μL(10 mmol / L)、cDNA 1 μL、ddH2O補足至20 μL。反應程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,35 個循環;72℃ 7 min,4℃保存[19]。反應完畢后,取7 μL PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。在120V恒壓條件下電泳25 min后,在凝膠成像系統上查看結果并保存。

1.2.2 測序

將擴增出的特異性條帶進行測序,得到的CP基因序列在NCBI網站中比對分析,選取NCBI上發布的分離物的CP基因完整序列。利用MEGA 7.0軟件的Clustal W法進行多序列比對分析以及鄰接法(neighbor joining,NJ)構建系統進化樹,系統進化樹中各分支置信度(bootsrap)進行1 000次重復分析。表2

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯感染病毒的癥狀

研究表明,在我國新疆烏魯木齊縣、奇臺縣、吉木薩爾縣、巴里坤縣、澤普縣等主產區進行采樣,馬鈴薯植株癥狀表現有矮化、花葉、卷葉等癥狀,病株葉片褪綠黃化,葉片邊緣有輕微內卷,葉片變脆增厚。圖1

表2 檢測5種病毒引物序列

圖1 馬鈴薯感染病毒后的癥狀Fig.1 Symptoms of a potato infected with a virus

2.2 病毒檢出率

研究表明,對87份樣本進行提取總RNA后,獲得cDNA,以cDNA為模板,用引物-F和-R進行PCR擴增。從87份樣本檢測出PVY、PVS、PLRV,其檢出率分別為100%、37.93%、6.89%,未檢出PVX、PVM病毒,其中4個樣本為PVY、PVS、PLRV三種病毒復合侵染,29個樣本為PVY、PVS兩種病毒復合侵染,1個樣本為PVY、PLRV兩種病毒復合侵染。表3

采集樣本均出現PVY特異性擴增條帶,鑒定為均帶PVY病毒。采用PVS特異性引物檢測出33份帶毒樣本;采用PLRV特異性引物檢測出6份帶毒樣本,分別為QT-9、QT-12、QT-13、QT-17、QT-20、QT-21,陰性樣本未擴增到相應的片段。表3,圖2

表3 馬鈴薯病毒RT-PCR檢出統計

圖2 馬鈴薯病毒RT-PCR電泳結果Fig.2 Results of RT-PCR electrophoresis of potato virus

2.3 PVY基因序列比對及進化樹

研究表明,從87份陽性樣本中獲得CP基因與NCBI上來自中國23份,法國2份,美國4份,埃及1份,哈薩克斯坦2份,斯洛伐克2份,南非1份,敘利亞1份,斯洛文尼亞1份,俄羅斯1份,波蘭4份,德國1份,共計43份,其中ZP-8、QT-21、JMS-43、QT-50、BLK-75號樣本CP基因序列與中國福建(KJ634023.1)、中國山東(EF592525)、波蘭(JF927762.1)、中國江蘇(MN734254)序列一致性達到100%,與其他國家的分離物的一致性達到99.04%以上。表4

表4 用于序列比對及進化的PVY基因序列

利用采集到的43個PVY分離物構建進化樹,以馬鈴薯A病毒(PVA)分離物NC004039作為外參,39個PVY分離物聚在兩個大的分支上,其中比較大的一個分支,ZP-3、BLK-74、ZP-8、QT-12聚在一個分支上;QT-16,QT-33聚類在另一個分支上,QT-27、ZP-6、JMS-40、JMS-41離上述兩個分支親緣關系較遠,根據進化樹顯示JMS-40和JMS-41的親緣關系最近,外類群NC004039離上述的43個分離物的關系最遠。圖3

2.4 PVS基因序列比對及進化樹

研究表明,從陽性樣本中獲得CP基因與NCBI上來自中國4份,蘇格蘭1份,匈牙利1份,俄羅斯2份,盧旺達1份,美國1份,伊朗1份,加拿大1份,共計12份PVS的cp基因序列進行同源性分析。其中ZP-2、ZP-7、QT-14、QT-15樣本CP基因序列與中國廣西(KF011279.1)、中國北京(MK387318.1)、中國山西(KC818635.1)、中國山西(KC818634.1)序列一致性達到97.59%以上,與其他國家的分離物的一致性達到96.1%以上。表5

圖3 在PVY測序序列基礎上構建的進化樹Fig.3 Evolutionary tree constructed on the basis of PVY sequencing sequences

表5 用于序列比對及進化分析的PVS基因序列

以馬鈴薯P病毒(PVP)分離物EU338239作為外參,利用采集到的12個PVS分離物構建進化樹,結果表明12個分離物中的9個可以清晰的分成2個主要的分支,QT-9、QT-12、QT-10、ZP-8、QT-11、QT-13分成一個分支,其中的QT-9、QT-12親緣關系最近,ZP-2、ZP-7、QT-14分成一個分支,ZP-7、QT-14親緣關系相對較近,QT-16、QT-15、ZP-6相對其他9個分離物親緣關系較遠,而ZP-6離其他11個分離物關系最遠。圖4

2.5 PLRV基因序列比對及進化樹

研究表明,從6份陽性樣本中獲得CP基因與NCBI上來自中國4份,坦桑尼亞1份,法國1份共計6份PLRV的CP基因序列進行同源性分析。其中QT-12樣本CP基因與坦桑尼亞(KC866618)序列一致性達到100%,QT-9、QT-17、QT-20、QT-21樣本CP基因序列與中國廣東(MF062487.1)、中國內蒙古(FJ859025)、中國河北石家莊(DQ315385)、中國內蒙古(KC456052)序列一致性達到99.06%,與法國的分離物的一致性達到99.62%以上。表6,圖5

圖4 在PVS測序序列基礎上構建進化樹Fig.4 Evolutionary tree constructed on the basis of PVS sequencing sequences

表 6 用于序列比對及進化分析的PLRV基因序列

QT-12、QT-13、QT-17、QT-20聚在一個分支上,其中QT-12、QT-13親緣關系較近,QT-9在這些分離物中親緣關系最遠。圖5

圖5 在PLRV測序序列基礎上 構建的進化樹

3 討 論

3.1研究新疆馬鈴薯主產區5個縣疑似馬鈴薯病毒病樣本,應用RT-PCR技術進行病毒病原鑒定,并對陽性樣本CP基因進行序列比對分析,結果表明,在自然環境中,PVY是危害該區域馬鈴薯樣本的主要病毒病原,一種或多種病毒的復合侵染馬鈴薯植株情況較為普遍,兩種及兩種以上病毒復合侵染可誘發比單一病毒更加嚴重的癥狀[20],由于馬鈴薯病毒病沒有有效的防治藥劑,需加強監管種薯生產中的病毒檢測及鑒定,依靠準確高效的檢測技術和手段來保證種薯質量[21]。

近年來國內外已報道的侵染馬鈴薯的病毒及類病毒超過40種,其中危害我國主要病毒病有PVY、PVX、PVS、PVM、PLRV、PVA,研究主要發現危害中國新疆的三種病毒病,與前期研究結果一致。胡新喜、范國權等[22-23]對我國四川省、湖南省、河北等地馬鈴薯病毒病進行鑒定研究,得出PVS檢出率最高,與此次研究PVY檢出率最高不相同,可見我國不同省(市、區)馬鈴薯病毒感染情況各不相同。

3.2目前,植物病毒病的檢測方法主要包括形態學方法、免疫學方法、分子生物學(核酸分子雜交技術、聚合酶鏈式反應技術、環介導等溫擴增技術)及納米生物傳感器技術等。病毒病防治技術從農業措施、抗病育種(莖尖脫毒繁育無病毒苗、植物病毒基因工程)、化學藥劑防治(植物病毒天然抑制劑、化學合成抑制劑)、弱毒疫苗接種等技術,測序(NGS)技術也在記錄和描述新型病毒和類病毒方面越來越流行[24-26]。

今后將計劃擴大病樣采集工作,開展小RNA深度測序及熒光定量PCR技術對感病植株攜帶病毒量進行定量分析,進一步闡明新疆馬鈴薯病毒病的分布情況。

4 結 論

4.1對87份樣本進行反轉錄聚合酶鏈式反應檢測,結果共檢測出PVY、PVS、PLRV,其中4個樣本為PVY、PVS、PLRV三種病毒復合侵染,29個樣本為PVY、PVS兩種病毒復合侵染。

4.2選出陽性樣本作為PCR擴增產物,PVY的CP核酸序列與中國福建(KJ634023.1)、中國山東(EF592525)、中國江蘇(MN734254)序列一致性達到100%,高于中國山西、寧夏、河南、吉林等地,ZP-2樣本PVS的CP核酸序列與中國廣西(KF011279.1)序列一致性達99.47%,中國新疆馬鈴薯主產縣的PVY及PVS病毒可能來自國內某個病毒病發生區。QT-12、QT-13樣本PLRV的CP核酸序列與坦桑尼亞(KC866618)序列一致性達到100%。中國新疆奇臺馬鈴薯疑似病毒病植株出現的黃化、卷葉癥狀,是由PVY、PVS、PLRV三種病毒復合侵染所致,其余主產區未發現三種病毒復合侵染情況。