中度嗜鹽菌Halomonas salifodinae N35-6產(chǎn)四氫嘧啶的培養(yǎng)基優(yōu)化

林 青,秦新政,高 雁,曾 軍,婁 愷,時紅玲,霍向東

(新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】四氫嘧啶是中度嗜鹽細菌中主要的滲透壓補償溶質(zhì),能夠作為穩(wěn)定劑保護和穩(wěn)定酶、細胞等抵抗高鹽、干燥、冷凍、高溫等逆境,起到抗逆協(xié)助作用。在制藥、食品、生物制劑、酶制劑、農(nóng)業(yè)和化學合成藥物、農(nóng)藥等領域具有較大的應用價值[1]。但是,由于四氫嘧啶含有一個手性碳原子,很難用化學方法合成。目前四氫嘧啶主要還是利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn),但由于產(chǎn)量低,成本高,制約了其推廣應用,因此利用微生物發(fā)酵提高四氫嘧啶的產(chǎn)率受到較多關注[2]。【前人研究進展】Galinski[3]在嗜鹽外硫紅螺菌中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀氨基酸結(jié)構的四氫嘧啶。后續(xù)又發(fā)現(xiàn)在嗜鹽的Halomonas、Chromohalobacter、Vibrio、Pseudomonas、Marinobacter、Brevibacterium、Streptomyces、Bacillus、Virgibacillus、Salibacillus、Halobacillus等屬微生物中也能產(chǎn)生四氫嘧啶[4]。國外利用H.elongata菌種以“細菌泌乳法”已經(jīng)實現(xiàn)四氫嘧啶的商業(yè)化生產(chǎn)[5]。Van-Thuoc 等[6]利用H.boliviensis,以兩步補料-分批發(fā)酵法使四氫嘧啶的產(chǎn)量達到了 9.1 g/(L·d)。Zhang 等[7]利用外泌型的H.salina分批發(fā)酵使四氫嘧啶的產(chǎn)量達到了 7.9 g/(L·d),該方法的優(yōu)點是菌株在相對較低的鹽濃度下就能將產(chǎn)物外泌到發(fā)酵液中,降低了高鹽對菌種生長的抑制和對設備的腐蝕。Chen等[8]通過優(yōu)化培養(yǎng)基與攪拌轉(zhuǎn)速,中度嗜鹽菌H.salinaBCRC17875的四氫嘧啶產(chǎn)量達到13.96 g/L。Ning等[9]構建的大腸桿菌基因工程菌株ECT05,采用流加發(fā)酵工藝,四氫嘧啶產(chǎn)量最高達25.1 g/L。Perez-Garcia[10]構建谷氨酸棒桿菌基因工程菌,四氫嘧啶產(chǎn)量最高達22 g/L。Li等[11]通過基因改造H.hydrothermalisY2,四氫嘧啶產(chǎn)量達到11.5 g/L,其中67%外泌到培養(yǎng)基中。Jiang[12]構建的目前四氫嘧啶產(chǎn)量最高的谷氨酸棒桿菌基因工程菌CB5L6,四氫嘧啶產(chǎn)量達到了45.52 g/L。【本研究切入點】目前許多研究者仍在發(fā)掘新的四氫嘧啶產(chǎn)生菌,但新疆耐鹽微生物資源的相關研究還很少報道。需進行中度嗜鹽菌HalomonassalifodinaeN35-6產(chǎn)四氫嘧啶的培養(yǎng)基優(yōu)化。【擬解決的關鍵問題】挖掘產(chǎn)四氫嘧啶的新疆耐鹽微生物資源, 研究其生產(chǎn)性能, 為新疆耐鹽微生物資源的利用和開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

采樣地點:新疆哈密七角井鹽湖(43°25′N, 71°30′E)。

分離培養(yǎng)基:R2A培養(yǎng)基(含3%、5%、10%、15%、20% NaCl) 和NA培養(yǎng)基(含3%、5%、10%、15%、20% NaCl)。

種子培養(yǎng)基(g/L): L-谷氨酸鈉10, KH2PO43, K2HPO4·3H2O 11.8, MgSO4·7H2O 0.4, MnSO4·H2O 0.01, FeCl20.05,酵母粉 5,葡萄糖 10,NaCl 30, pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): KH2PO43, K2HPO4·3H2O 11.8, MgSO4·7H2O 0.4, MnSO4·H2O 0.01, FeCl20.05,(酵母粉、L-谷氨酸鈉 、NH4Cl、葡萄糖 、NaCl 試驗設計添加量),pH 7.2。

1.2 方 法

1.2.1 耐鹽菌的分離

取1 g土樣稀釋至105,取100 μL涂布于分離培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)72 h后,挑取培養(yǎng)基上生長的單菌落保存。

1.2.2 分子鑒定

采用細菌通用引物:27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′與1 492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增反應體系:上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL,2×PCR mix(含Taq酶1.25 U/25 μL) 25 μL,模板DNA 2 μL,無菌ddH2O補足50 μL,陰性對照為不加模板DNA。PCR條件:94℃ 4 min;94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,30個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物由北京新時代眾合科技生物公司測序。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化

優(yōu)化酵母粉、L-谷氨酸鈉(MSG)、NH4Cl、葡萄糖、NaCl的添加量對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響。菌株接種于裝有1 mL種子培養(yǎng)液的96孔深孔板,150 r/min,30℃培養(yǎng)48 h,5 000 r/min離心5 min,去除上清,加入1 mL發(fā)酵培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,5 000 r/min,10 min離心收集菌體,加1 mL 80%乙醇振蕩重懸,靜置過夜,10 000 r/min,10 min離心取上清。表1

1.2.4 四氫嘧啶的檢測

HPLC(Agilent 1260),液相色譜柱為Welch Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250 mm,5 μm)及配套保護柱;進樣量20 μL,流動相為100%H2O,流速1 mL/min,柱溫30℃,紫外波長210 nm檢測四氫嘧啶的含量。

表1 因子水平編碼

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Minitab18軟件采用Box-behnken設計實驗、分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA 序列的同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹

研究表明,以菌株N35-6基因組DNA為模版,采用細菌通用引物進行PCR擴增,得到1 416 bp的PCR產(chǎn)物。菌株N35-6的16S rDNA序列GenBank登錄號(OP143846)。N35-6菌株與H.salifodinaeBC7菌株(EF527873)的核苷酸序列同源性達99.15%。菌株N35-6與H.salifodinaeBC7菌株(AB245343)聚為一簇,與菌株N35-6的親緣關系最近,確定該菌株為H.salifodinaeN35-6。圖1

2.2 回歸方程建立與變量影響

研究表明,酵母粉(X1)、L-谷氨酸鈉(X2)、NH4Cl(X3)、葡萄糖(X4)、NaCl(X5)等5個因子與四氫嘧啶產(chǎn)量間的數(shù)學模型方程如下:

Y=0.740 + 0.049 4X1- 0.007 91X2- 0.024 2X3- 0.006 93X5- 0.007 17X4- 0.001 196X1×X1+ 0.000 004X2×X2+ 0.000 259X3×X3+ 0.000 013X5×X5- 0.000 095X4×X4- 0.000 810X1×X2- 0.000 946X1×X3+ 0.000 192X1×X5+ 0.000 712X1×X4+ 0.000 470X2×X3+ 0.000 060X2×X5+ 0.000 106X2×X4+ 0.000 113X3×X5- 0.000 043X3×X4+ 0.000 040X5×X4(R2=0.838 7)。

圖1 菌株Halomonas salifodinae N35-6系統(tǒng)進化樹

圖2 因子影響四氫嘧啶產(chǎn)量的pareto 圖Fig.2 Pareto chart evaluates the variables affecting ectoine production

2.3 因子間交互效應對四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

研究表明,隨著酵母粉、NaCl、葡萄糖濃度的增加,四氫嘧啶產(chǎn)量呈逐漸增加的趨勢,但隨著L-谷氨酸鈉、NH4Cl濃度的增加,四氫嘧啶產(chǎn)量呈逐漸降低的趨勢。酵母粉、L-谷氨酸鈉、NH4Cl、葡萄糖、NaCl等5個因子間的交互作用對四氫嘧啶產(chǎn)量沒有顯著影響(α=0.05)。圖3

2.4 四氫嘧啶產(chǎn)生最佳培養(yǎng)基的優(yōu)化和驗證

研究表明,得到最優(yōu)培養(yǎng)條件為酵母粉 15 g/L、L-谷氨酸鈉 10 g/L、NH4Cl 2 g/L、葡萄糖 40 g/L、NaCl 150 g/L。在最優(yōu)條件下,通過發(fā)酵驗證,得到四氫嘧啶產(chǎn)量平均值為0.83 g/L,與預測值1.02 g/L相近。模型預測可靠。

3 討 論

3.1四氫嘧啶作為相容性溶質(zhì),可在嗜鹽菌或耐鹽菌胞內(nèi)大量積聚,是微生物適應高鹽、高滲透壓和紫外輻射等環(huán)境,維持其在逆境中的正常生長,具有細胞和生物大分子保護作用[13-15]。四氫嘧啶的相關研究包括新菌株的篩選、已有菌株的基因工程改造、培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝的優(yōu)化[1]。已有研究表明氯化鈉、酵母粉、L-谷氨酸鈉、銨鹽是影響耐鹽、嗜鹽微生物生長及胞內(nèi)四氫嘧啶積累的培養(yǎng)基關鍵成分[16-18]。

3.2試驗優(yōu)化結(jié)果表明培養(yǎng)基中酵母粉是影響H.salifodinaeN35-6四氫嘧啶產(chǎn)量的最顯著因子,酵母粉濃度15 g/L時,四氫嘧啶產(chǎn)量最高,與Wei等[19]酵母粉促進Marinococcussp.ECT1四氫嘧啶積累的結(jié)果一致。培養(yǎng)基中的NaCl顯著影響H.salifodinaeN35-6四氫嘧啶的產(chǎn)量,這與NaCl顯著影響耐鹽菌、嗜鹽菌中四氫嘧啶的積累結(jié)果一致[6,20],NaCl濃度150 g/L時,H.salifodinaeN35-6四氫嘧啶的產(chǎn)量最高。培養(yǎng)基中的銨鹽對H.salifodinaeN35-6四氫嘧啶的產(chǎn)量影響顯著,合適的銨鹽濃度有利于四氫嘧啶的積累[8,17,21,22]。但與已有結(jié)果不同,研究中L-谷氨酸鈉對四氫嘧啶的產(chǎn)量影響不顯著。利用H.salifodinaeN35-6生產(chǎn)四氫嘧啶的發(fā)酵工藝還需進一步優(yōu)化。

表2 響應面二次模型的方差

4 結(jié) 論

分離到一株能夠產(chǎn)四氫嘧啶的細菌菌株N35-6,其親緣關系與H.salifodinae菌株 BC7最近,確定菌株N35-6屬于H.salifodinae。菌株N35-6四氫嘧啶產(chǎn)量可達0.83 g/L。菌株中度嗜鹽菌H.salifodinaeN35-6具有高產(chǎn)四氫嘧啶的潛力。

圖3 Ectoine 產(chǎn)量影響因子交互作用曲面圖Fig.3 Interactions plots of variables affecting ectoine production