番茄早疫病菌dsRNA多樣性分析

劉升學(xué),李思琪,王曉東,楊德松

(1.石河子大學(xué)分析測試中心,新疆石河子 832000;2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】番茄早疫病(Alatenariasolani)在新疆各番茄種植區(qū)均有發(fā)生,常年發(fā)病率在50%以上,可危害番茄植株的葉片和莖,造成番茄早衰,影響番茄產(chǎn)量,感染果實(shí)后造成果實(shí)霉?fàn)€[1]。番茄早疫病是由鏈格孢(Alternariasolani)侵染引起的一種氣傳病害,在新疆番茄種植區(qū)普遍發(fā)生。有效控制早疫病是確保新疆加工番茄豐產(chǎn)、豐收的重要措施之一。利用攜帶病毒的弱毒株引起病原菌群體致病力衰退,將成為真菌病害生物防治的新途徑[2-3]。【前人研究進(jìn)展】從植物病原真菌到大型食用真菌 (不包括真菌介體傳播的非真菌病毒) 普遍存在病毒[4-6],其中一些真菌病毒侵染后能夠減弱植物病原真菌的致病性,從而可用于植物病害的防治。Dodds等[7]證明在板栗疫病菌(Cryphonectria.parasitica)弱毒株中分離到的dsRNA粒體與其寄主出現(xiàn)致病力減弱現(xiàn)象有關(guān),之后成功利用板栗疫病弱毒病毒Cryphonectriahypovirus1(CHV1) 控制了栗樹疫病, 成為了利用致病力衰退相關(guān)的真菌病毒生防植物真菌病害最為經(jīng)典的實(shí)例[8-10]。 Yu 等[11]在核盤菌菌株 DT - 8 中發(fā)現(xiàn)了真菌 DNA 病毒SclerotiniasclerotiorumhypovirulenceassociatedDNAvirus1(SsHADV1),發(fā)現(xiàn)其可以引起核盤菌致病力減弱;Wu 等[12]在灰霉菌中發(fā)現(xiàn)了使寄主致病力減弱的 dsRNA病毒BotrytisporriRNAvirus1 (BpRV 1);Li 等[13]在鐮刀菌中發(fā)現(xiàn)了具有弱毒特性的 RNA 病毒FusariumgraminearumHypovirus2(FgHV2);曹鈺晗等[14]通過對蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的鏈格孢蘋果專化型(A.alternataf.sp.mali)dsRNA分析,攜帶 dsRNA 的菌株多為弱致病力菌株,致病力最低的 QY-2 菌株攜帶Alternariaalternatachrysovirus2(AaCV2),可能具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,可為蘋果斑點(diǎn)落葉病提供新的生防資源。鏈格孢屬(Alternariassp)也存在真菌病毒。Shepherd從棉花種子分離到的21株Alternariaalternata菌株中,有6株含1.0～5.1 kbp的3條dsRNA,其中兩個(gè)分離物的dsRNA與30 nm大小的病毒粒體相關(guān)聯(lián)[15]。Zabalgogeazcoa等[16]從A.solani分離得到包裹在80～100 nm的球狀膜囊泡中、沒有殼體化、大小為8.3和5.5 kbp的dsRNA。Hayashi等[17]報(bào)道,12株A.alternata日本梨致病型中7株中含有1.0～8.0 kbp的dsRNA。Aoki等[18]從A.alternata分離得到EGS 35-193,含有大小為3 617、2 794、2 576和1 420 bp的四條dsRNA,觀察到EGS 35-193減弱菌絲生長和菌落色素沉積,被命名為A.alternatavirus1 (AaV1)。Fuke等[19]從日本梨樹的病原菌A.alternata分離到N18,含有幾條dsRNA,使菌落生長表現(xiàn)出不規(guī)則和非正常的菌落色澤等表型特性,給予寄主菌細(xì)胞如細(xì)胞凋亡之類的負(fù)面影響。Lin 等[20]從煙草赤星病A.longipes分離得到 dsRNA 病毒AlternarilongipesdsRNA virus 1(AlRV1)。KOMATSU 等[21]從喬木鏈格孢(A.arborescens) 中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的維多利亞病毒Alternariaarborescensvictorivirus1(AaVV1);ZHONG等[22]從蕓薹生鏈格孢(A.brassicicola)中發(fā)現(xiàn)病毒Alternariabrassicicolafusarivirus1(AbFV1);向均[23]從鏈格孢日本梨致病型中分離出病毒Alternariabotybirnavirus1 (ABRV1);OKADA等[24]從鏈格孢日本梨致病型中分離出病毒Alternariaalternatachrysovirus1(AaCV1),損害宿主真菌的生長,同時(shí)影響宿主AK毒素的產(chǎn)生。曹鈺晗等[14]通過對A.alternataf.sp.mali 的dsRNA研究,確定含有5組分的AaCV2。【本研究切入點(diǎn)】目前,已報(bào)道了多種作物鏈格孢屬真菌病毒,但關(guān)于番茄早疫病菌真菌病毒還未見報(bào)道,有待進(jìn)一步解析。【擬解決的關(guān)鍵問題】采集新疆石河子周邊加工番茄早疫病菌樣品,通過提取dsRNA和序列分析,分析加工番茄早疫病病菌(A.sonali)攜帶病毒的情況,為研究利用真菌病毒來控制番茄早疫病害提供生防資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

供試菌株2015～2022年分別采自新疆石河子周邊加工番茄種植區(qū),通過組織分離法和單孢分離得到純培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器

CF-11Wwaters公司;Tris、SDS、EDTA-Na、乙酸鈉上海生工生物技術(shù)有限公司;TaqMix、感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒,Tiangen公司;氨芐、麥康凱北京Solarbio公司;載體 pGM-T Promega公司;pMD19-T、PrimScript TMreagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa公司;臺式冷凍高速離心機(jī)(5425R)Eppendorf公司;PCR儀、電泳儀,BIO公司;BioRad 凝膠成像系統(tǒng),美國 SYNGENE 公司;超凈工作臺,江蘇蘇凈集團(tuán)公司。

1.2 方 法

1.2.1 dsRNA的提取

病毒dsRNA的提取方法采用纖維素CF-11吸附法。提取到的dsRNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.2 RT-PCR

1.2.2.1 引物合成

隨機(jī)引物RP26:5’-GACGTCCAGATCGCGAATTCNNNNNN-3’,RP20:5’-GACGTCCAGATCGCGAATTC-3’參照文獻(xiàn)[25],通用引物T7、SP6,均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,M13F、M13R北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2.2 RT-PCR

提取到的dsRNA經(jīng)65℃變性后合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25 μL,95℃預(yù)變性5 min,95℃30 s,56℃30 s,72℃1 min,循環(huán)30次后,72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收400～1 000 bpDNA條帶區(qū)域。回收產(chǎn)物與pGM-T /pMD19-T克隆載體于16℃連接30 min后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,37℃過夜培養(yǎng)。菌落PCR篩選陽性克隆,隨機(jī)挑選96個(gè)序列測定,委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果及數(shù)據(jù)處理等借助DNAMAN軟件完成。利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫的Blast搜索比對同源序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA提取結(jié)果

研究表明,用纖維素(CF-11)吸附法從分離到的191早疫病菌株(2015年采36株、2016采16株、2022采139株)中提取dsRNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察,有43株中檢測到1～4條dsRNA條帶,其帶毒率為22.5%。其中22菌株檢測到1條dsRNA,占總株數(shù)的11.5%,占帶毒株數(shù)的51.1%;菌株A8、A9、A13、A18、A32、AS1、AS5、AS10、T4、T64、S1、S7和S8的大小約為10 kb,G3、G4、S11、S13、H80和H81約為8 kb,H74、H86和H101約為3.7 kb。有14株菌株中檢測到2條dsRNA條帶,占總株數(shù)的7.3%,占帶毒株數(shù)的32.6%;A24和AS24大小約為5.5和1.7 kb,A12、A33、AS4、H5、H6、H63、H114和H116約為4.0和3.5 kb,H77約為3.0和3.0 kb,A6、H4和H84約為2.5和2 kb。有5株菌株中檢測到3條dsRNA條帶,占總株數(shù)的2.6%,占帶毒株數(shù)的11.6%;H49和H53大小約為8、4和3.5 kb,H79、H82和H83約為7.0、3.5和3.0 kb。有2株菌株中檢測到4條dsRNA條帶,占總株數(shù)的1.1%,占帶毒株數(shù)的4.7%;A19和AS11大小約為10、4、3和1 kb。圖1

注:M,DNA Maker;A、AS、T、G、H代表菌株(a樣品采自2015年,b采自2016年,c、d采自2022年不同集結(jié)季節(jié))

2.2 RT-PCR

研究表明,以AS24、G3、S8、T4、H63和H74株菌的dsRNA為模板,用RP26和RP20為引物進(jìn)行RT-PCR,得到200～1 500 bp彌散DNA條帶,回收400～1 000 bp的區(qū)域,純化后克隆到pGEM-T/pDM19-T上,選取經(jīng)PCR檢測為陽性的96個(gè)單克隆進(jìn)行序列測定。

2.3 序列測定(表1)

2.3.1 AS24菌株

AS24菌株攜帶兩條dsRNA,經(jīng)拼接得到組分1(dsRNA-L)大小為2 506 nt和組分2(dsRNA-S)1 483 nt的Contigs。dsRNA-L與整體病毒科(Totiviridae)的Helminthosporiumvictoriaevirus190S(HvV 190S)外殼蛋白和RdRp(RNA dependent RNA polymerase genes)的序列同源性為63%,與Bipolarismaydisvictorivirus(BmV1)BmV1b/CY27、BmV1c/CY27和BmV1d/CY27株系的序列同源性為62.0%;dsRNA-S與雙分病毒科(Partitiviridae)的Alternariatenuissimapartitivirus1(AtPV1) RNA2、PlasmoparaviticolalesionassociatedPartitivirus10(PVLaPV10) 的DMG-B_DN51686分離物、Erysiphenecatorassociatedpartitivirus8(ENaPV8)的PMS-DN6389分離物外殼蛋白序列序列同源性分別為54%、53%和51%;AS24菌株攜帶的兩條dsRNA分別是Totiviridae和Partitiviridae的兩種病毒。

2.3.2 G3菌株

G3得到1 189、694和889 nt的三個(gè)Contigs、Contigs1與Totiviridae的AaVV1、ConiothyriumminitansRNAvirus(CmRV)序列同源性為74%、59%;Contigs2和Contigs3與Totiviridae的Uncultured totivirus RdRp相對應(yīng)區(qū)域的同源性為90%和100%;表明G3菌株攜帶兩種Totiviridae的病毒。

2.3.3 S8菌株

S8菌株得到3 411和559 nt的三個(gè)Contigs、Contigs1與Totiviridae的AaVV1 基因組RNA和CmRV分離物CmRV-IL序列同源性為92%,與Bipolarismaydisvictorivirus2(BmVV2) 株系CY05 外殼蛋白的序列同源性分別為81%;Contigs2與Partitiviridae的Ustilaginoideavirensnonsegmentedvirus1(UvNV-1)株系 GX-10 同源性為23%;表明S8菌株攜帶Totiviridae和Partitiviridae兩種病毒。

2.3.4 T4菌株

T4菌株得到大小分別為877、364、878和371 nt 4個(gè)Contigs。Contigs1、2和3未找到有同源性的序列,可能是未知新病毒的序列。Contigs4與蕪菁黃花葉病毒科(Tymoviridae)的Triticumpolonicummycotymovirus1 (TpMV1)復(fù)制酶HP2和 HP3的序列同源性為99%,T4菌株除了攜帶Tymoviridae的一種病毒,還可能攜帶一種未知新病毒。

2.3.5 H74菌株

H74菌株得到3 262 nt的Contigs,與未分類的 AlRV1株系HN28序列同源性99%,是不同來源的同一種病毒的不同分離物。

2.3.6 H63菌株

H63的兩條dsRNA獲得大小為3 684、22 532、825、1 105和1 418 nt 5個(gè)Contigs,Contigs1、2、4和5分別對應(yīng)于產(chǎn)黃青霉病毒科(Chrysoviridae)的AaCV1 RNA1-4。Contigs1與 AaCV1分離物CREA-VE-32SY2和AaCV1的RNA1序列同源性達(dá)98%,與株系QY-2為86%;Contigs2與RNA2序列同源性達(dá)83%;Contigs4與RNA3序列同源性為97%;Contigs5與RNA4 序列同源性分別為64%和99%。但Contigs3則與裸露病毒科(Narnaviridae)的Erysiphenecatorassociatednarnavirus27(ENaNV27)分離物PMS2_317序列同源性為93%。H63菌株攜帶分屬于Chrysoviridae與Narnaviridae的兩種病毒。

3 討 論

3.1目前,對于番茄早疫病防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥,而化學(xué)農(nóng)藥的過度使用威脅食品安全,導(dǎo)致環(huán)境污染和病原菌抗藥性增強(qiáng)。真菌病毒是能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖的病毒,其中一些真菌病毒侵染后能夠減弱植物病原真菌的致病性,從而可用于植物病害的防治。自從CHV1成功的控制了栗樹疫病[8-10],以真菌病毒為核心的生防產(chǎn)品的研發(fā)和應(yīng)用能夠減少化學(xué)農(nóng)藥用量、延緩病原菌的抗藥性。Chiba 等[26]從蘋果白色根腐病的病原真菌(Rosellinianecatrix)中分離的 W799 具有研制成生防試劑的潛力。Yu X等[27]從核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)中分離的病毒 SsHADV-1,證實(shí)可以在寄主的營養(yǎng)體不親和型菌株之間擴(kuò)散和復(fù)制,并引起健康宿主菌株致病力衰退,預(yù)示者 SsHADV-1 具有良好的生防潛能。曹鈺晗等[14]研究認(rèn)為,采自我國蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌菌株中致病力弱的 QY-2 菌株所攜帶AaCV2病毒,可為防治蘋果斑點(diǎn)落葉病提供新的生防資源。研究通過分離培養(yǎng)A.sonali,提取dsRNA篩選帶病毒菌株,其帶病毒率為22.0%,為篩選致病力弱,開發(fā)具有生防潛質(zhì)的菌株提供資源。

3.2已報(bào)道的鏈格孢屬的真菌病毒,其RNA類型有ssRNA和dsRNA兩種類型,核酸組分從1條鏈到多條鏈不等,片段大小也不盡相同。從棉花種子中分離出6個(gè)攜帶真菌病毒的鏈格孢菌株,dsRNA片段在1.0～5.1 kb[15];從茄鏈格孢中檢測到兩條dsRNA大小分別為 8.3和5.5 kb[16];另外還有真菌病毒AaV1(dsRNA片段:3 617、2 794、2 576、1 420 bp)[18]、AlRV1(dsRNA 片段:3145 bp)[20]、AaVV1(dsRNA片段:5 203 bp)[21]、AbFV1(ssRNA片段:6 639 bp)[22]、ABRV1(dsRNA片段:6 188、5 903 bp)[23]、AaCV1(dsRNA片段:3 647、2 857、2 785、2 772、836 bp)[24],AaCV2(兩條dsRNA條帶對應(yīng)于3 665、3 054、2 824、2 819、8 31 bp)[14],兩條dsRNA不同鏈格孢菌株攜帶 dsRNA 存在差異。研究從42菌株中提取的dsRNA,檢測到1條、或2條、或3條、或4條dsRNA條帶,在分子量大小上也存在差異。番茄早疫病中dsRNA具有一定的普遍性,根據(jù)條帶數(shù)量和分子量大小來看,病毒種類具有多樣性。但對應(yīng)于dsRNA條帶的病毒種類,有可能是單一的一種病毒,也有可能是基因組大小相近的多種病毒復(fù)合侵染所形成,還有可能是一種病毒的不同組分。從蘋果斑點(diǎn)落葉病菌分離得到QY-2菌株的dsRNA通過瓊脂糖凝膠電泳時(shí)觀察到大小兩條dsRNA帶[17],經(jīng)序列分是一種病毒的5個(gè)RNA組分,dsRNA1-4在電泳時(shí)形成混合的一條帶,dsRNA5是一條分子量小的帶,因此,對于獲得dsRNA具體是哪種病毒,還得通過其他的研究手段進(jìn)一步確定。從G3、S8、T4和H74菌株提取到的dsRNA,瓊脂糖凝膠電泳均觀察到1條dsRNA條帶,序列分析和Blast比對發(fā)現(xiàn),僅菌株H74攜帶AlRV1一種病毒,而G3、S8、T4攜帶至少兩種病毒,G3菌株攜帶的病毒與Totiviridae的AaVV1、CmRV和Uncultured totivirus 存在序列同源性;S8菌株攜帶的一種病毒與Totiviridae的AaVV1、CmRV、 BmVV2存在序列同源性,另一種病毒則與Partitiviridae的UvNV-1存在同源性,兩種病毒分屬于不同的科;T4菌株的一種病毒與Tymoviridae的TpMV1的序列同源性為99%,而有三段片段經(jīng)Blast比對未找到有同源性的序列,可能是未知新病毒的序列。對于提取到兩條dsRNA帶的AS24和H63菌株, AS24的大片段dsRNA-L攜帶的病毒與已報(bào)道的Totiviridae的HvV 190S、BmV1存在序列同源性;而小片段dsRNA-S攜帶的病毒與Partitivirus病毒的AtPV1、PVLaPV10、ENaPV8存在序列同源性,分屬于不同科的兩種病毒。H63菌株同樣觀察到兩條dsRNA條帶,兩條dsRNA分別對應(yīng)于Chrysoviridae的AaCV1的RNA1-4,是一種病毒的不同組分;另外還檢測到與Narnaviridae的成員ENaNV27存在同源性片段。通過對提取到的dsRNA序列分析和blast比對進(jìn)一步表明,番茄早疫病菌不同分離物攜帶多種病毒,檢測到的病毒分屬于Totiviridae、Partitiviridae、Chrysoviridae、Tymoviridae和Narnaviridae,不僅存在多樣性,而且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象,其中有些病毒是已經(jīng)報(bào)道的病毒或者是其新的株系,有些還可能是未被揭示的新病毒。

表1 測得序列BLAST比對

4 結(jié) 論

番茄早疫病菌菌株攜帶 dsRNA 的概率在22.5%左右。攜帶的dsRNA存在多樣性。番茄早疫病菌菌株攜帶的病毒也存在多樣性,不僅攜帶多種病毒,而且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象,已經(jīng)檢測到的病毒分屬于Totiviridae、Partitiviridae、Tymoviridae、Tymoviridae和Narnaviridae。