鷹嘴豆種子代謝產物的GC-MS分析

王 威,徐 樂,樊艷星,王 帆,馬艷明,唐中華

(1.新疆農業科學院農作物品種資源研究所,烏魯木齊 830091;2.新疆農業科學院,烏魯木齊 830091;3.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室,哈爾濱 150040)

0 引 言

【研究意義】鷹嘴豆(CicerarietinumL.)為一年生或多年生草本植物,在豆科類作物中居第3位,栽培地區主要分布于地中海沿岸、亞洲、非洲、美洲等地。鷹嘴豆是一種適宜在冷涼地區生長的豆類作物,鷹嘴豆在我國新疆、青海、甘肅種植較多,內蒙古也有少部分地區種植。鷹嘴豆具有極其豐富的營養價值和藥用價值。鷹嘴豆中含有人類所需六大營養素,富含多種植物蛋白和氨基酸、維生素、粗纖維及鈣、鎂、鐵、銅、鋅、錳、鍶等微量元素等成分[1-5],具有很高的食用價值。此外,鷹嘴豆中富含大豆肽、異黃酮等物質[6]。牛磺酸[11],屬有機酸,可以調節體內微量元素的平衡,促進動物的健康,保護機體的正常功能。牛磺酸是動物正常發育所必需的,當牛磺酸缺乏時,生長、組織分化和免疫發育都會出現缺陷;奎尼酸[12],具有降血脂的生物活性。鷹嘴豆的脂質總含量為4.5～6.0 g/100 g[13]。其中脂肪酸主要為亞油酸(47.30%),油酸(36.90%),α-亞麻酸(2.35%),棕櫚酸(9.51%)和硬脂酸(1.57%)[14]。與豌豆、蠶豆、綠豆、赤豆、黑豆和黃豆相比,鷹嘴豆中油酸的相對含量最高,總不飽和脂肪酸含量高達86.55%,α-亞麻酸和硬脂酸的相對含量最低。不飽和脂肪酸具"高油酸、低α-亞麻酸"的組成特點[15]。鷹嘴豆中的兩種多不飽和脂肪酸(亞油酸和油酸)約占鷹嘴豆總脂肪量50%～60%[16]。鷹嘴豆富含植物蛋白和10多種氨基酸[17-19],每100 g干鷹嘴豆中蛋白質含量為8.9 g,遠高于山藥、燕麥、苦蕎和馬鈴薯;每100 g蛋白質含谷氨酸17.3 g、亮氨酸8.7 g、賴氨酸7.2 g。鷹嘴豆的蛋白質功效比值、生物利用價值和消化吸收率指標,遠遠高于其它豆類[19]。每100 g干鷹嘴豆中碳水化合物含量為27.4 g[18]。如:單糖、雙糖、低聚糖、多糖,以及不能消化吸收的無效碳水化合物如:纖維素。鷹嘴豆淀粉含量高于黑豆(33.6%)和馬鈴薯(15%)[19]。與小麥等谷物相比鷹嘴豆淀粉含量略低,但其種子中直鏈淀粉含量較高(鷹嘴豆30%～40%,小麥25%)[20]。DF是鷹嘴豆的精華部分,鷹嘴豆總DF含量為18～22 g/100g,DF濃度是谷類或油籽豆類的兩倍以上[21]。分為可溶性和不可溶性膳食纖維[22],可溶性膳食纖維約占鷹嘴豆種子重量的4.8%,不可溶膳食纖維占10.18%[23]。其中乙醇胺[24]在哺乳動物中具有多種免疫功能;肉桂醇[25]有抗炎、抗氧化等作用。Pittaway J K[26]稱膳食中添加鷹嘴豆可以降低總血清膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平。兒茶素[27]具有抗氧化、清除自由基、抑制脂質過氧化、提高膜穩定性等活性,毒扁豆堿[28]和山柰酚[29]亦有一定的療效。研究分析鷹嘴豆品種之間代謝產物的GC-MS差異,對鷹嘴豆產品的開發有重要意義。【前人研究進展】吳霞等[7]應用GC-MS分析技術對鷹嘴豆中弱極性成分進行研究,從中鑒定出了以脂肪酸為主的22個化合物;高鵬等[8]利用GC-MS法對鷹嘴豆脂肪酸組成及含量進行了分析測定結果表明,從鷹嘴豆油中鑒定出 5種脂肪酸,鷹嘴豆油中不飽和脂肪酸含量均達到 80%以上;塔西買買提·吐爾汗[9]通過 GC-MS分析,發現鷹嘴豆油最主要的化學成分為亞油酸;趙華杰等[10]用GC-MS法從鷹嘴豆豆漿中檢測到不飽和脂肪酸氧化生成的31種小分子揮發性成分。【本研究切入點】代謝組學主要是對動植物體內的代謝產物進行定量、定性分析,是通過高通量檢測和統計學方法研究動植物體內代謝規律。目前利用 GC-MS技術對鷹嘴豆初級代謝產物進行代謝組學分析的報道較少。需研究鷹嘴豆品種之間代謝物質的差異。【擬解決的關鍵問題】通過非靶向代謝組學,研究10個不同來源的鷹嘴豆品種種子的代謝產物,分析不同品種的代謝差異,為鷹嘴豆食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

參試材料為近年來國家作物種質資源庫(新疆分庫)收集保存的國內外鷹嘴豆品種10個,來自2021年在新疆農業科學院綜合試驗場種植收獲的種子。 表1

表1 參試鷹嘴豆品種

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

采用GC-MS(氣相色譜-質譜聯用分析方法)進行代謝組學分析,每品種3次重復。使用研缽將種子研磨成細粉,取60 mg樣品轉移到1.5 mL管中,加入360 μL甲醇(-20℃預冷)和40 μL 2-L-氯-苯丙氨酸提取代謝物,渦旋振蕩2 min,超聲處理30 min。 加入200 μL氯仿和400 μL水,再次超聲處理30 min。4℃下140 000 r/min離心10 min。將上清液轉移至玻璃瓶中,自然蒸發至干。將干燥的殘余物重新溶解于80 μL甲氧基胺吡啶溶液(15 mg/mL)中并在37℃下孵育90 min。隨后,將80 μL等分試樣的BSTFA(包括1%TMCS)和20 μL加入混合物中,渦旋2 min,在70℃下孵育60 min。將溶液以12 000 r/min離心5 min除去沉淀物,將上清液轉移到玻璃瓶中。

1.2.2 基于GC-MS的代謝組學

將每重復1 μL試樣的溶液以無分流模式注入Agilent 7890A-5975C GC-MS系統(Agilent,USA)。在非極性DB-5毛細管柱(30 m×250 μm內徑,J&W Scientific,Folsom,CA)上以高純度氦氣作為載氣以1.0 mL/min的恒定流速進行分離。GC溫度編程從60℃開始,以8℃/min的速率升高至125℃,接著以4℃/min的速率升高至210℃,再以5℃/min的速率到270℃,最后以10℃/min的速率升高至305℃,在305℃下保持3 min。 電子碰撞(EI)離子源保持在260℃,能量為-70 eV。以每秒 20個光譜的速率,50～600的全掃描模式下獲得質譜數據。

色譜分離在Ultra-Performance LC(UPLC)系統(Waters,Japan)上進行,使用LC-20AD泵,溫度控制器,柱溫箱,SIL-20A自動進樣器(Waters,Japan)和ACQUITY UPLC BEH C18柱(使用具有在線過濾器并保持在25℃的1.7 μm,2.1 mm×50 mm)。 UPLC測定中的流動相由(A)水和(B)乙腈組成。洗脫程序優化如下:30%B(0～4.5 min),30%～60%B(4.5～6 min),60%～90%B(6～6.5 min),90%B(6.5～7.5 min),90%～30%B(7.5～8 min),30%B(8～10 min)。流速為0.25 mL/min,注射體積為5 μL。在配備有正離子檢測模式的電噴霧電離(ESI)源的QTRAP 5500離子阱質譜儀(AB SCIEX,USA)上進行串聯質譜檢測。

1.3 數據處理

使用Agilent GC/MS 5975數據分析軟件將原始GC-MS數據轉換成CDF格式(Channel Definition Format,NetCDF),隨后由XCMS(www.bioconductor.org)處理。每種代謝物以標準化的峰面積表示。將標準化數據導入SIMCA-P軟件(版本11.0,http://www.umetrics.com/simca)進行多變量統計分析,用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。使用從PLS-DA模型獲得統計學顯著性閾值來鑒定鑒別代謝物,并通過t-檢驗分析進一步驗證。選擇VIP值大于1.0且P值低于0.05(閾值)的代謝物作為不同類別樣品之間的區別代謝物。

2 結果與分析

2.1 鷹嘴豆種子代謝產物類別

研究表明,所測定的化合物共分為有機酸類、脂肪酸類、氨基酸類、糖類、醇類、酚類以及含氮類等幾大類化合物。有機酸衍生物36種,脂肪酸衍生物12種,氨基酸衍生物36種,糖類衍生物5種,醇類衍生物10種,酚類化合物8種,含氮化合物16種,其他化合物23種。表2

2.2 鷹嘴豆種子代謝產物的聚類

研究表明,將化合物的Q值將鷹嘴豆的品種分為4小類。10個不同的鷹嘴豆品種均含有大量的酸類、糖醇類以及含氮類等幾大類化合物,氨基酸類及其衍生物分布相對較少。其中,第Ⅳ類的D2016-10作為單獨的一小類其化合物分布不同于其他品種,相較于其他9個品種,含有較多的氨基酸類及其衍生物的積累,以及極少的糖類積累;第Ⅰ類的YZD103和YZD99 2個品種作為一小類積累較多的脂肪酸類、醇類和含氮類化合物,與第Ⅲ類的YZD06、D2016-12和D2016-11 3個品種類似;第Ⅱ類的YZD86、YZD01、D2016-2和YZD80 4個品種包含的化合物種類及含量較多,涉及到有機酸、脂肪酸、糖醇類、含氮類以及酚類化合物的分布。

表2 鷹嘴豆種子的甲醇提取物中鑒定的主要成分比較

續表2 鷹嘴豆種子的甲醇提取物中鑒定的主要成分比較

續表2 鷹嘴豆種子的甲醇提取物中鑒定的主要成分比較

酸類化合物富集主要包括有機酸和脂肪酸。其中,D2016-2、D2016-10、YZD86、YZD06和YZD01等5個品種積累較多的酸類化合物,其中除D2016-10以外其余4個品種明顯積累較多的脂肪酸類化合物;除此之外,YZD80極為特殊,其富含的酸類物質極少,只有極個別的酸類化合物含量較多,體現為肌氨酸酐、奎尼酸、吲哚乙酸和正辛酸等幾種。

氨基酸類及其衍生物富集類似于酸類物質的分布。其中,大多數的鷹嘴豆品種均含有較高含量的氨基酸及其衍生物類的化合物,除編號YZD80之外。此外,10個鷹嘴豆品種含有較高含量的幾種固有的氨基酸種類,包括脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸以及組氨酸等幾種必需氨基酸,但D2016-10和YZD80 2個品種含量明顯低于其他品種。YZD80品種其含有的較高含量的氨基酸類化合物為絲氨酸、谷氨酸、乙酰基亮氨酸、羥基色氨酸和脯氨酰胺等氨基酸類化合物。而D2016-10則富集異丁胺、丙二胺、酮纈氨酸、酮代異亮氨酸、谷氨酰胺、羥化瓜氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、乙酰賴氨酸、酪氨酸以及甲基組胺等化合物,以衍生物類為主。

糖醇類及其衍生物積累包括糖類和醇類。大多數的品種均含有較高含量的糖醇類化合物,并以醇類化合物為主,YZD80除外。10個品種均含有固定的幾種化合物,分別為乙醇胺、丙二醇和甘油等,但D2016-10和YZD80 2個品種其含量明顯較低,尤其是YZD80。其中,D2016-10主要包括脫水葡萄糖、兒茶酚和肉桂醇等化合物,而YZD80主要體現為半乳糖胺和葡糖胺等糖類衍生物含量較高。此外,D2016-2、YZD06和YZ86還包含脫水葡萄糖、兒茶酚和肉桂醇等化合物,類似于D2016-10,但含量均低于D2016-10。D2016-12、YZD103和YZD99 3個品種還富集到較高含量的半乳糖胺、苯甲醇和葡萄糖醇等物質。

圖1 GC-MS提取的10種鷹嘴豆品種的代謝物譜的Q值的分級聚類Fig.1 hierarchical cluster analysis of Q value of metabolite spectrum of 10 chickpea germplasm extracted by GC-MS

D2106-2、YZD01和YZD06 3個品種測定到的兩大類為酚類物質和含氮類化合物含量較高。10個品種均含有烷胺和脫氧鳥苷,但D2016-10和YZD80含量明顯較低,其中D2016-10積累較多的色胺、脫硫生物素、苯肼和氨基嘌呤等化合物,而YZD80則含有較高的多巴胺和亞精胺等化合物。此外,除D2016-2和D2016-10 2個品種外,其他品種均含有較高的多巴胺。

D2016-10和YZD80 2個品種化合物積累明顯與其他8個品種有顯著差異,尤其是YZD80,8個品種針對每一大類的化合物均含有相同的某幾種化合物的分布,而D2016-10和YZD80則積累自身特定的較高的化合物含量,而與其他8種相同累積的化合物的含量明顯偏少。但2個品種所積累情況完全不同,因此二者存在各自的特異性。圖1,圖2

3 討 論

3.1 GC-MS分析方法的應用

近年來,國內對氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)的應用研究比較廣泛,在中醫藥[30]、水質[31]、農藥殘留[32]、肉制品、果蔬等食品風味[33]、石油化工[34]等領域的檢測均有應用。GC-MS在鷹嘴豆的檢測分析也有報道,楊柳等[35]用頂空固相微萃取-氣質聯用技術(HS-SPME-GC-MS)對鷹嘴豆納豆揮發性成分進行了測定與分析。趙華杰等[10]采用減壓蒸餾與固相萃取聯用的方式提取鷹嘴豆豆漿中的揮發性成分,并用氣相色譜-質譜聯用儀進行成分的分析鑒定,以峰面積歸一化法對各成分進行定量。塔西買買提·吐爾汗[9]對迪西型鷹嘴豆油進行物理化學分析和GC-MS分析,確定了鷹嘴豆油最主要的化學成分為亞油酸。高鵬等[8]采用索氏提取法提取了來自不同產地的鷹嘴豆中的油,經甲酯化處理利用GC-MS法對其脂肪酸組成及含量進行了分析測定。吳霞等[7]應用氣相色譜-質譜分析技術,對鷹嘴豆中弱極性成分進行了研究。

3.2 鷹嘴豆代謝組分的營養功能

鷹嘴豆中的糖類主要包括半乳糖、核糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖等,具有抗氧化、抗疲勞和調節膽固醇等生理活性[36];鷹嘴豆蛋白質含量較為豐富,約為12.6%～30.5%,高于核桃、燕麥等多種谷物[19],且多為優質蛋白,具有抗氧化、抗衰老等活性[37]。鷹嘴豆含有的氨基酸種類較多,共18種,主要包括亮氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、纈氨酸等。安馨等[38]選用新疆木壘縣的鷹嘴豆為原料,采用WHO/FAO理想蛋白質氨基酸組成模式分析測定鷹嘴豆中的氨基酸種類與含量發現,必需氨基酸中亮氨酸的含量最高,約為70.0 mg/g,其次為苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸,非必需氨基酸中谷氨酸含量最高,約為108.0 mg/g。鷹嘴豆中還富含亞油酸、十八烯酸等大量的不飽和脂肪酸,作為衡量食物營養價值重要參考指標之一的亞油酸含量最高,約為47.3%,因其能夠發揮預防糖尿病等功效,使得鷹嘴豆的食用和藥用價值得以提高[39]。鷹嘴豆還含有多種維生素類物質,主要包括硫胺素、核黃素、VA、VC和VE等[40];此外,鷹嘴豆中鐵、鋅、鎂、鈣、鉀以及硒等微量元素較為豐富,對于組成生物大分子,維持機體正常的生命活動也發揮著重要的作用[41]。

3.3 鷹嘴豆的應用價值

錢宗耀等[42]采用GC-MS技術,對市售9種豆類(鷹嘴豆、黃豆、青豆、花蕓豆、扁豆、豌豆、綠豆、黑豆、紅豆)中的脂肪酸組分進行含量測定,結果表明,9種豆類樣品脂肪酸組分及含量均有差異,其中青豆的總脂肪含量最高,鷹嘴豆的不飽和脂肪酸含量最高。楊美娟等[43]對鷹嘴豆中蛋白質、含油率、脂肪酸等進行檢測,認為鷹嘴豆蛋白質含量豐富,含油率較低,不飽和脂肪酸含量高,具有降低膽固醇、促進新陳代謝、預防動脈粥樣硬化的功效。孫鳳等[44]采用GC-MS法分析鷹嘴豆脂肪酸成分,發現鷹嘴豆脂肪酸種類特別豐富,主要含有13種脂肪酸,其中不飽和脂肪酸占83.5%,油酸、亞油酸含量較多。

4 結 論

從10種鷹嘴豆供試品種中檢測到146種化合物,主要包含機酸類、脂肪酸類、氨基酸類、糖類、醇類、酚類以及含氮類等七大類功能不同的物質;代謝產物經熱圖聚類可將10個鷹嘴豆品種分為4個代謝產物不同的小類,其中8個品種針對每一大類的化合物均含有相同的某幾種化合物的分布,而D2016-10和YZD80則積累自身特定的較高的化合物含量,較其他8種相同累積的化合物的含量明顯偏少,且該2個品種所積累情況完全不同,二者存在各自代謝產物的特異性。