海島棉β-胡蘿卜素異構(gòu)酶GbD27-6基因克隆及表達(dá)分析

劉晨曦,朱雨婷,周 強,陳 瑾,趙文杰,鄭 凱,2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室,烏魯木齊 830052; 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后流動站,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】植物株型是影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因素,受到溫度、光周期、營養(yǎng)條件等外界環(huán)境因素以及遺傳和植物內(nèi)源激素等內(nèi)部因素調(diào)控,其中,遺傳和內(nèi)源激素占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。此外,分枝發(fā)育對植物株型十分重要,該過程主要受到一類新型激素獨腳金內(nèi)酯(strigolacyone,SL)的精準(zhǔn)調(diào)控[2]。獨腳金內(nèi)酯是一種多功能激素,有助于控制枝條分枝,并且作為植物與叢枝菌根真菌之間以及寄主植物與寄生獨腳金植物之間的信號分子。獨腳金是一類重要的植物激素,調(diào)控了植物的生長、發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境刺激的過程。其中D27基因使植物能夠合成和調(diào)控獨腳金激素水平,從而促進促進幼芽伸長進而增加植株高度、調(diào)控植物的花芽形成和開花過程、參與果實的發(fā)育和成熟過程、在種子的萌發(fā)和休眠狀態(tài)的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮作用等。活性的獨腳金內(nèi)酯會進一步代謝為其他形式的獨腳金激素,這些激素在植物的不同組織和器官種起到特定的生理調(diào)節(jié)作用。需要注意的是,獨腳金合成途徑是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),包括多個酶、基因和反應(yīng)。【前人研究進展】在缺乏磷的情況下,植物根會產(chǎn)生大量的獨腳金內(nèi)酯分泌物,是菌根形成共生過程重要的信號分子[3-5]。類胡蘿卜素脫氧、氧化生成獨腳金醇,繼而轉(zhuǎn)化成不同的獨腳金內(nèi)酯物質(zhì)[6,7]。該合成通路涉及到許多基因,當(dāng)這些基因發(fā)生變化時,植株的生長發(fā)育隨之受到影響。獨腳金內(nèi)酯對番茄磷的吸收上發(fā)揮作用[8]通過調(diào)控赤霉素合成參與擬南芥種子萌發(fā)[9]、以及調(diào)控主根伸長及抑制側(cè)根生長作用等[10]。棉花作為一種深根作物,根系十分發(fā)達(dá)[11],獨腳金內(nèi)酯通過調(diào)控根系的生長從而影響營養(yǎng)和水分的吸收[10],進而影響棉花纖維的發(fā)育。以玉米、高粱等植物的類胡蘿卜素缺失突變體并加以類胡蘿卜素生物合成抑制劑的處理,發(fā)現(xiàn)SL來源于類胡蘿卜素生物合成途徑[7,12],屬于其衍生的化合物。擬南芥、水稻和豌豆等不同植物的SL缺失突變體表現(xiàn)出更多分枝的表型,并且該表型可以通過外源施加其人工合成類似物GR24得到恢復(fù),從而揭示出植物體SL的生物合成起始于質(zhì)體[13]。該過程至少存在5種酶的參與[1,14]。D27、CCD7與CCD8都定位于質(zhì)體內(nèi)部,P450則位于質(zhì)體外部。獨腳金內(nèi)酯屬于類胡蘿卜素衍生的一種根際激素信號分子,而D27是其重要的轉(zhuǎn)錄基因,可以產(chǎn)生獨腳金內(nèi)酯前體或中間產(chǎn)物[1,6]。【本研究切入點】棉纖維發(fā)育的起始期、伸長期、次生壁增厚期、成熟期4個時期中,伸長期和次生壁增厚期同時開始,產(chǎn)生了交叉的生長時域[15]。棉花纖維的遺傳機制極其復(fù)雜。現(xiàn)在已知獨腳金內(nèi)酯是調(diào)控植物分枝發(fā)育的關(guān)鍵因子,但是關(guān)于獨腳金內(nèi)酯在棉花纖維發(fā)育中作用尚不清楚,其功能機制、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面還不清楚[10,16,17]。需研究GbD27-6基因在海島棉分枝和側(cè)枝生長中的影響作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對海島棉GbD27-6基因的克隆和表達(dá)分析,研究其在棉纖維的表達(dá)特性及獨腳金內(nèi)酯在海島棉纖維生長發(fā)育過程中的作用,為進一步研究D27基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

海島棉材料PimaS-7由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室棉花分子遺傳育種課題組所提供。海島棉種植于新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)科所試驗站。

1.2 方 法

1.2.1 海島棉GbD27-6基因克隆及生信

使用天根生物植物總RNA提取試劑盒,用于提取海島棉PimaS-7在5、10、15、20、25、30 d各個時期的棉纖維總RNA(以開花當(dāng)天作為纖維發(fā)育0 d)。將提取的RNA進行質(zhì)量檢測并在1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,合格后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA第一鏈。多數(shù)物種D27基因家族都存在一個名為DUF4033的蛋白保守結(jié)構(gòu)域,將其導(dǎo)入棉花基因組數(shù)據(jù)庫在線比對得到D27基因蛋白保守序列,利用此保守結(jié)構(gòu)域序列在海島棉基因組數(shù)據(jù)庫中進一步比對得到海島棉GbD27-6基因。

以海島棉PimaS-7的cDNA為模板,使用50 μL擴增體系:TransStartTaqDNA Polymerase 250 U(全式金)高保真酶25 μL、cDNA 2 μL、Forward primer和Reverse primer各1 μL,其余加Nucleasw-free Water 21 μL補齊體系。擴增目的基因反應(yīng)程序為預(yù)變性94℃ 5 min;變性94℃ 30 s,退火62.4℃ 30 s,延伸72℃ 1 min,35個循環(huán);延伸72℃ 10 min獲得目的基因片段。表1

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒,回收特異性擴增的目的基因,與T5線性化載體25℃連接30 min,重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中通過卡納霉素標(biāo)記進行篩選,并挑選單菌落于37℃搖床培養(yǎng)。菌液PCR陽性鑒定后,將陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 引物序列

1.2.2 海島棉GbD27-6基因的表達(dá)特性

分別提取海島棉PimaS-7在不同纖維發(fā)育時期、不同花器官的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。采用熒光定量試劑盒按說明書對熒光定量體系進行配置[13]。選擇UBQ7作為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR分析平臺為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。單次試驗中每個樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),以內(nèi)參基因UBQ7作為對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用諸多在線軟件進行生物信息學(xué)分析,用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。表2

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉GbD27-6基因的克隆

研究表明,條帶大小為850 bp左右,與預(yù)測大小一致。GbD27-6基因長為816 bp,編碼271個氨基酸。PCR陽性菌液產(chǎn)物顯示符合上述預(yù)測及分析結(jié)果。圖1,圖2

表2 生信分析軟件

注:M:DL2000 DNA maker;1:GbD27-6基因的擴增產(chǎn)物

注:M:DL2000 DNA maker;2:GbD27-6基因菌液的陽性鑒定

2.2 海島棉GbD27-6蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測

研究表明,GbD27-6蛋白含有8個外顯子和7個內(nèi)含子,分子式為C1335H2134N350O389S24,分子量為30.081 18 kDa,理論等電點(pI)為8.40(>7),脂肪系數(shù)為85.57,不穩(wěn)定系數(shù)為50.15(>40),該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。疏水氨基酸殘基數(shù)目多于親水氨基酸殘基數(shù)。該蛋白屬于疏水性蛋白。GbD27-6蛋白主要在細(xì)胞膜分布,其為分泌性蛋白。圖3

圖3 海島棉GbD27-6的親疏水性Fig.3 Hydrophilic and hydrophobic analysis of GbD27-6 in Gossypium barbadense

2.3 海島棉GbD27-6蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

研究表明,使用在線軟件對GbD27-6蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,二級結(jié)構(gòu)中有133個無規(guī)則卷曲(占49.08%)、88個α-螺旋(占32.47%)、37個延伸鏈(占13.65%)、13個β-轉(zhuǎn)角(占13.80%)。該蛋白屬于異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)蛋白,推測該蛋白需要與其他蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮功能。表3,圖4

2.4 海島棉GbD27-6蛋白質(zhì)信號肽、跨膜區(qū)、保守結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點預(yù)測

研究表明,該基因不具有信號肽,GbD27-6蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。圖5,圖6

表3 GbD27-6蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4 GbD27-6蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Tertiary structure prediction of GbD27-6 protein

圖5 海島棉GbD27-6的信號肽預(yù)測Fig.5 Prediction of signal peptide of GbD27-6 in Gossypium barbadense

圖6 海島棉GbD27-6的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.6 Prediction of transmembrane region of GbD27-6 in Gossypium barbadense

GbD27-6蛋白是DUF4033超家族的成員,含有DUF4033結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),與擬南芥葉綠體β-胡蘿卜素異構(gòu)酶D27高度類似,通過催化全反式β-胡蘿卜素中C9-C10雙鍵的異構(gòu)化導(dǎo)致9-順式β-胡蘿卜素并為CCD7提供底物,參與鏈內(nèi)酯的生物合成。其結(jié)合位點出現(xiàn)于靠近多肽鏈N端一端。結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)完成生理功能有著密切的關(guān)系,預(yù)測該結(jié)構(gòu)域占據(jù)重要的作用。圖7

該蛋白質(zhì)磷酸化位點中絲氨酸磷酸化多于蘇氨酸多于酪氨酸。圖8

圖7 海島棉GbD27-6的保守結(jié)構(gòu)域Fig.7 Conserved structural domain of GbD27-6 in Gossypium barbadense

2.5 海島棉GbD27-6基因保守基序、多序列比對和系統(tǒng)進化樹

研究表明,篩選NCBI數(shù)據(jù)庫的信息,選取7條同源性較近的物種序列(巴西海島棉(KAB2003250.1)、陸地棉(XP 016695906.1)、戴維遜棉(MBA0617518.1)、松散棉(MBA0715122.1)、旱地棉(MBA0686082.1)、可可樹(XP 007051131.2;EOX95288.1)),都含有3個相同的保守基序;經(jīng)DNAMAN進行多序列比對,結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析結(jié)果找出DUF4033蛋白結(jié)構(gòu)域。圖9,圖10

圖8 海島棉GbD27-6的磷酸化位點Fig.8 Phosphorylation site of GbD27-6 in Gossypium barbadense

圖9 GbD27-6與其他植物保守基序預(yù)測分析Fig.9 Predictive analysis of GbD27-6 and conservated motif in other plants

圖10 GbD27-6與其他植物氨基酸序列比對Fig.10 Analysis of amino acid sequence alignment between GbD27-6 and other plants

海島棉GbD27-6蛋白除與巴西海島棉(KAB2003250.1)、陸地棉(XP 016695906.1)等棉屬的蛋白距離較近外,還與可可屬可可樹(XP 007051131.2)、榴蓮屬榴蓮(XP 022757850.1)等的蛋白距離較近;與梨屬白梨(XP 009349930.2)、獼猴桃屬獼猴桃(PSS14736.1)的距離較遠(yuǎn)。海島棉GbD27-6基因可能與可可樹D27具有相似功能(圖中海島棉(GbD27-6);巴西海島棉(KAB2003250.1;PPD89448.1;PPS11066.1);陸地棉(XP 016695906.1;XP 016710237.1;KAG4119971.1;XP 016695907.1;XP 040936992.1);戴維遜棉(MBA0617518.1);松散棉(MBA0715122.1);旱地棉(MBA0686082.1);雷蒙德氏棉(XP 012490306.1;XP 012490307.1;KJB41793.1);擬似棉(MBA0741465.1);司篤克氏棉(KAH1081179.1);黃褐棉(TYJ09133.1);樹棉(XP 017631093.1;KHG05677.1)斯溫迪芒氏棉(MBA0861344.1);哈克西尼棉(MBA0802487.1);毛棉(TYI00282.1);可可樹(XP 007051131.2;EOX95288.1);榴蓮(XP 022757850.1);木槿(XP 039007481.1);長蒴黃麻(OMO82110.1);板栗(KAF3964893.1);芒果(XP 044501650.1;XP 044501649.1;XP 044501652.1);美洲山核桃(KAG7967178.1;KAG2693308.1;XP 042991374.1);歐洲栓皮櫟(XP 023904362.1);核桃(XP 018822128.1);番木瓜(XP 021904458.1);加利佛尼亞白櫟(XP 030948830.1);文冠果(KAH7578239.1);灰籽南瓜(KAG7025594.1))。圖11

圖11 海島棉GbD27-6蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.11 Phylogenetic tree analysis of GbD27-6 protein in sea island cotto

2.6 海島棉GbD27-6基因在不同組織中的表達(dá)特性

2.6.1GbD27-6基因在海島棉不用組織中的的表達(dá)

研究表明,GbD27-6基因在花瓣、花藥、苞葉中均有表達(dá),但其表達(dá)量在不同器官中存在差異。GbD27-6基因在苞葉中表達(dá)量最高,顯著高于其他兩個器官(P<0.05);在花瓣、花藥中表達(dá)量較低,兩者中表達(dá)量差異不顯著,花藥表達(dá)量略高于花瓣。苞葉中的相對表達(dá)量約為花藥的34倍,約為花瓣的48倍。GbD27-6基因在花瓣、花藥、苞葉中表達(dá)量的比例約為1∶1.4∶48.2。GbD27-6基因或許在花期起著不可替代的作用。圖12

注:*、**和***表示同一基因不同處理間在0.05、0.01、0.001水平差異顯著,下同

2.6.2GbD27-6基因在海島棉不同纖維發(fā)育時期的表達(dá)特性

研究表明,GbD27-6基因在纖維發(fā)育20 d時表達(dá)量最高,顯著高于其它時期(P<0.05);在纖維發(fā)育30 d時次之;在纖維發(fā)育5、25和35 d時再次之;在纖維發(fā)育0和10 d中表達(dá)量最低。GbD27-6基因可能在纖維的伸長期有著重要的作用。圖13

3 討 論

3.1D27基因在其中途徑起到了特定的催化作用,是整個途徑的重要組成部分。沈月等[10]研究發(fā)現(xiàn),獨腳金內(nèi)酯與植物激素互作對植株根系產(chǎn)生影響。在番茄幼苗培養(yǎng)中,獨腳金內(nèi)酯的處理可以增加野生型、max1和max4的分生區(qū)皮層細(xì)胞數(shù)目而促進主根伸長,作用機制為抑制生長素轉(zhuǎn)運,增加分生區(qū)和過渡區(qū)大小,促進主根伸長;與細(xì)胞分裂素互作調(diào)控主根的發(fā)育;與乙烯協(xié)同促進根毛伸長。張艷培[14]等通過試驗發(fā)現(xiàn),f2-132突變體是水稻中編碼CCD7酶的D17/HTD1基因發(fā)生點突變,導(dǎo)致獨腳金內(nèi)酯無法合成,從而表現(xiàn)出半矮化多分蘗的表型,利用獨腳金內(nèi)酯人工合成類似物GR24進行處理,分蘗表型又恢復(fù)正常,證明了f2-132的矮化多分蘗表型是由于獨腳金內(nèi)酯合成受阻造成的。D27基因?qū)儆贒UF4033超家族成員,含有特有結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)類似于擬南芥葉綠體β-胡蘿卜素異構(gòu)酶D27,該基因通過催化全反式β-胡蘿卜素中C9-C10雙鍵的異構(gòu)化導(dǎo)致9-順式β-胡蘿卜素為CCD7提供底物,參與鏈內(nèi)酯的生物合成。研究從海島棉品種PimaS-7纖維中克隆獲得GbD27-6基因,生信分析顯示與其他植物D27基因具有較高的相似性,證明了所克隆基因的準(zhǔn)確性。對其氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),該基因編碼271個氨基酸,編碼的蛋白不穩(wěn)定,屬于疏水蛋白且不存在跨膜結(jié)構(gòu)。對GbD27-6蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示其二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成,以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主,具有D27蛋白的典型特征。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明蛋白屬于異質(zhì)二聚體蛋白,推測與其他蛋白互作形成二聚體發(fā)揮功能。根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析推測海島棉GbD27-6的蛋白序列與陸地棉,可可、榴蓮有較近的進化關(guān)系,與白梨,獼猴桃進化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖13 GbD27-6基因在海島棉不同 纖維發(fā)育時期的基因表達(dá)量

3.2植物中GbD27-6基因在不同組織、不同發(fā)育時期的表達(dá)存在差異,通過基因表達(dá)的組織差異性可以預(yù)測基因?qū)u棉纖維發(fā)育可能存在調(diào)控作用。根據(jù)海島棉三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選到GbD27-6基因序列,利用在線軟件設(shè)計特異性引物,以海島棉PimaS-7的cDNA為模板擴增GbD27-6基因[17,18]。海島棉GbD27-6基因在苞葉、花藥、花瓣中均有表達(dá),但存在較大差異。其在苞葉中表達(dá)量最高,顯著高于花藥、花瓣的表達(dá)量。在苞葉中的表達(dá)量約為花藥的35倍、花瓣的45倍。孫洪影[1]研究結(jié)果表明,草莓FveD27基因表達(dá)量在新葉與莖尖部位較高,其次是葉柄和老葉。該研究的組織器官雖有所不同,但同樣證明了D27基因在苞葉中表達(dá)量最高。不同發(fā)育時期的基因表達(dá)量也差異較大:20～30 d時表達(dá)量達(dá)到頂峰,纖維發(fā)育5、25和35 d時次之;纖維發(fā)育0和10 d中表達(dá)量最低。在20 d的基因表達(dá)量約為30 d時的1.7倍,5 d時的5.5倍,25 d時的6.05倍,35 d的9.2倍,15 d的12.3倍,0 d的27倍,10 d的48倍。由于開花當(dāng)天作為棉纖維發(fā)育0 d,當(dāng)棉花纖維發(fā)育10 d時,棉花正處于盛花期,單株開花日增長量最多,生殖生長開始強于營養(yǎng)生長,營養(yǎng)分配以供應(yīng)花鈴為主,葉面積指數(shù)達(dá)到最大值,導(dǎo)致10 d時基因表達(dá)量最小。

推測該基因在20 d至30 d時控制纖維發(fā)育最強,可在此時期深入研究GbD27基因的調(diào)控機理。海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)異,使得其優(yōu)于其他棉屬,基于此現(xiàn)狀,將進一步深入研究D27基因的生物學(xué)功能,為今后開展海島棉纖維品質(zhì)、株型等發(fā)育研究以及新品種的選育提供理論支持。

4 結(jié) 論

從海島棉Pimas-7中克隆得到了GbD27-6基因,該基因編碼區(qū)全長816 bp,編碼271個氨基酸,蛋白分子式為C1335H2134N350O389S24,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大約為30.081 18 kDa,理論等電點(pI)為8.40,屬不穩(wěn)定疏水蛋白,不存在跨膜結(jié)構(gòu),其二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角構(gòu)成,三級結(jié)構(gòu)屬異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)蛋白,需要與其他蛋白結(jié)合發(fā)揮作用。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示該蛋白主要存在于細(xì)胞膜。GbD27-6基因在纖維發(fā)育20 d至30 d表達(dá)量達(dá)到頂峰且在10 d時表達(dá)量最低。