基于絲蛋白納米顆粒負載抗癌藥物遞送系統的研究進展

吳建兵, 李靖雯, 周欣楠, 孫銀銀, 王永峰

(1.常熟理工學院 紡織服裝與設計學院,江蘇 蘇州 215500; 2.中國科學院 蘇州納米技術與納米仿生所國際實驗室,江蘇 蘇州 215123)

癌癥已嚴重威脅人類生命健康,隨著全球老年化進程加快,癌癥發病率和致死率都在迅速上升,給家庭和社會帶來沉重負擔[1]。手術切除和放射療法是目前最直接、最有效的治療手段,但僅適用于局部和非轉移性腫瘤。早期癌癥具有隱匿性,當病人出現不適癥狀時已發展到中晚期,只能依靠化學療法控制[2]。抗癌化療藥物在人體分布具有隨機性,癌細胞被殺傷的同時也會損傷正常細胞。除此之外,抗癌藥物存在血液循環清除快、易脫靶,生物利用度低等問題[3]。因此化學療法的弊端逐漸顯現,包括給藥次數多,周期長,且對器官毒副作用大,易誘發神經病變、自身免疫系統及泌尿生殖系統功能障礙。從而導致其療效不佳,病人順應性差[4]。如何針對中晚期癌癥病人,靈活選擇對患者順應性高、抗毒副作用低、生物利用度高、耐受性好的治療方法是目前醫學界亟須解決的關鍵問題。利用腫瘤組織與正常組織環境的差異,包括血管密度、滲透性及細胞外基質中特異性蛋白等來設計多功能靶向給藥系統,使得藥物能在較長時間內滯留在腫瘤微環境中,促使癌細胞徹底凋亡且不再復發、轉移是抗癌藥物精準高效治療的有效策略。

抗癌藥物遞送系統是將抗癌藥物裝載在無機或有機高分子聚合物基質中,通過不同給藥途徑進入人體,再經血液循環將藥物遞送至癌變部位,在較長時間內維持藥物治療濃度,充分發揮藥物療效的技術[5]。因此,在穩定藥物活性、精準靶向給藥、控制藥物釋放、降低藥物毒性、提高藥物療效等方面具有突出優勢。遞送載體尺寸決定了給藥方式,納米級一般經靜脈注射后通過全身血液循環到達腫瘤部位[6];而微米級需要通過局部給藥鎖定在靶向實體瘤中,長時間不斷地向腫瘤微環境中釋放藥物,維持藥物濃度[7]。相比于微米級載體,納米級可直接經被、主動方式進入癌變細胞內,靶向更精準,可顯著提高藥物生物利用度[8]。被動靶向是指遞送載體能在血液循環中利用腫瘤組織與正常組織中的血管密度及滲透性差異自發滯留,或作為異物被免疫系統中的巨噬細胞吞噬等途徑進入細胞中;主動靶向是指在遞送載體表面先修飾靶向分子,再與腫瘤微環境中的特異性受體結合后經胞吞作用進入細胞中,完成藥物釋放,促使癌細胞凋亡,作用方式如圖1[9]所示。

抗癌藥物在靶向遞送過程中,存在一系列問題,包括易與血漿蛋白之間發生非特異性吸附,易被腎臟排泄或被肝臟中的網狀內皮系統(Reticuloendothelial system, RES)攝取,使得靶器官中的藥物濃度低,生物利用度差。將抗癌藥物負載在納米脂質體中減少腎排泄較易被實現[10],而如何減少并避免藥物被肝臟RES攝取仍是重大挑戰。目前使用高分子聚合物納米顆粒進行藥物遞送是解決該問題的高效方法之一[11]。載體材料的穩定性和生物相容性是抗癌藥物遞送系統研究的前提和基礎。作為抗癌藥物遞送的納米顆粒在制備及功能化設計時需要考慮四條原則:1) 穩定抗癌藥物活性、降低抗癌藥物在血液循環中的損失及對正常組織的毒副作用;2) 需對其進行化學修飾,避免直接被人體代謝器官例如肝臟中的免疫細胞及血管內皮細胞等清除,延長其在血液循環中的滯留時間;3) 充分利用腫瘤微環境促使納米微粒透過內皮富集作用,加快其透過血管內皮,再滲透至靶向部位;4) 持久可控釋放,加快腫瘤細胞凋亡同時降低耐藥性風險[12]。目前載體材料來源主要包括天然聚合物和合成聚合物兩種。合成聚合物主要以聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)[13],聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)[14],聚己內酯(Polycaprolactone,PCL)[15],聚乙醇酸(Polyglycolic acid,PGA)[16],聚乳酸羥基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)[17]為主,盡管合成聚合物在抗癌藥物遞送系統中的研究取得突破進展,但在實際應用中仍存在問題。如PLGA等聚合物材料體內降解時的酸性產物會與大分子抗癌藥物發生酰化反應[18];在藥物制劑高溫滅菌過程中,PLGA等會發生降解,無法對抗癌藥物起到穩定和保護。另外,在納米顆粒制備過程中添加有機溶劑、引發劑等化學物質,藥物制劑存在安全隱患[19]。相比合成聚合物,天然聚合物可塑性強,可通過物理或化學方法靈活、高效負載抗癌藥物,穩定抗癌藥物活性的同時,實現抗癌藥物的可控、精準釋放,且能在自然環境中進行酶降解,降解產物對人體和環境均無害[20]。基于此,本文重點對作為天然聚合物熱點材料之一的絲蛋白,從絲蛋白的結構與性能、絲蛋白納米顆粒(Silk fibroin nanoparticles,SF NPs)的制備方法機理及優缺點、理化性能(粒徑、表面電荷、穩定性)對抗癌藥物裝載、釋放的影響及其用于被、主動靶向中的具體研究進展進行詳細闡述,為發展基于SF NPs負載抗癌藥物實現高效遞送及治療研究提供思路。

1 絲蛋白的結構與性能

國內外已有多項研究證實,蠶絲或蜘蛛絲中的絲蛋白具有優異的生物相容性、極低的免疫原性,且已經作為生物材料被廣泛運用[21-22]。蜘蛛絲力學和防水性能優異,但同類相食,產量低、成本高,來源受限[23]。目前,家蠶和柞蠶是絲蛋白最主要的兩類來源(圖2)[24]。蠶絲蛋白由18種氨基酸組成,基本結構是由相對分子質量約為350 kDa的重鏈、25 kDa的輕鏈及起連接作用的二硫鍵構成的二聚體。蠶絲蛋白(Silk fibroin,SF)由疏水結晶區和親水非結晶區交替構成(圖3)[24],其中,結晶區由α-螺旋、β-折疊(亞穩定狀態正交晶系的Silk Ⅰ-平行β-折疊、穩定狀態單斜晶系的Silk Ⅱ-反平行β-折疊)兩種蛋白質二級結構構成。

圖2 絲蛋白的關鍵優勢特性Fig.2 Key advantageous properties of silk proteins

相比無定形態和Silk Ⅰ,Silk Ⅱ的構象最穩定(圖4)[25]。SF二級結構可相互轉換,全水相下的SF以無規卷曲為主,其在外界因素影響下,例如溫度[26]、濕度[27]、pH值[28]、剪切力[29]、金屬離子[30]、溶劑種類[31]等條件可促使無規卷曲向β-折疊轉變。因此利用這些特性可調控SF中無定形、Silk Ⅰ、Silk Ⅱ三者之間的比例,增加SF NPs中Silk Ⅱ的比例有助于疏水性抗癌藥物,包括姜黃素、紫杉醇裝載效率的提升[12],且載體基質的穩定性、降解性、抗癌藥物的負載及釋藥性能均可調控。總而言之,SF在抗癌藥物遞送方面具有顯著優勢:1) 具有優異的生物相容性、生物安全性,免疫原性低;2) 高度重復的疏水晶體與親水非晶體交替排列,可形成納米微纖網絡,有利于小分子抗癌藥物的高效負載并實現可控釋放;3) 具有豐富的活性氨基酸,例如酪氨酸、賴氨酸、精氨酸等,可為抗癌藥物的共價耦聯或化學修飾提供足夠的反應位點,有助于主動靶向遞送;4) 可在全水相下自組裝形成納米顆粒,避免了有機溶劑添加對多肽、蛋白質等具有生物活性抗癌藥物穩定性的影響[9],藥物療效和生物安全性得到保證;5) 明膠等高分子材料易在高溫下發生變性交聯反應和降解,而SF作為結構蛋白,可與多種滅菌方法兼容,作為抗癌活性藥物制劑的穩定劑和保護劑;6) 可被細胞內溶酶體降解后補充天然組織的營養成分,能滿足載體降解的關鍵要求。因此SF可成為理想的抗癌藥物遞送載體材料。

圖3 蠶絲蛋白一級結構和二級結構之間關系的示意Fig.3 Schematic diagram of the relationship between primary and secondary structure of silk fibroin

圖4 桑蠶絲蛋白的二級結構Fig.4 Secondary structure of mulberry silk protein

2 SF納微米顆粒的形成原理及制備方法的優缺點

SF由親水氨基酸(如谷氨酸)和疏水氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)組成,其分子間的親/疏性鏈段排列交替且規整,SF在選擇性溶劑中能發生自組裝而形成膠束[32]、聚集體[33]等不同結構的穩定形態,也可通過油相[34],電壓[35],超臨界CO2[36]、直接噴霧[37]等不同途徑先獲得SF液滴,再在外界刺激下(溫度[38]、濕度[39]、離子強度[40]、變性劑[41])誘導SF的構象發生改變(從無規卷曲轉變到β-折疊),進而形成穩定的水不溶的SF納微米顆粒。根據SF的雙親性和自組裝特性,可將SF納微米顆粒的形成原理分為“從小到大”和“從大到小”兩種。

2.1 “從小到大”

SF納微米顆粒“從小到大”的形成原理是SF先由分子自組裝形成納米晶核,緊接著形成多晶核的聚集體顆粒。具體過程是全水相的SF溶液在變性劑[41]、pH值[42]、低溫[32]等條件下先誘導SF形成納米晶核,再在氫鍵、離子鍵、疏水作用力等作用下進一步自組裝形成穩定的納米顆粒,其中SF的二級結構會從不穩定的無規卷曲向穩定的β-折疊轉變,該原理涉及的制備方法主要包括鹽析法、反溶劑法等(圖5)[21]。

圖5 制備絲蛋白納米顆粒方法的示意Fig.5 Schematic summary of techniques for the preparation of silk nanoparticles

2.2 “從大到小”

“從大到小”的形成原理又細分為兩種,一種是從SF溶液出發,SF溶液先均勻分散成納微米小液滴,再去水固化。干燥過程包括瞬間高溫固化[37]、60 ℃烘箱緩慢干燥[43]及在常溫液中干燥等[41],此時二級結構以α-螺旋為主,需再經甲醇[41]、水蒸氣[39]等后處理才能形成穩定的SF納微米球(高β-折疊含量),也可通過添加化學交聯劑(京尼平[44]、戊二醛[45])使液滴固化成球,制備方法主要包括靜電噴霧干燥法、超臨界流體法、微乳化法(圖5)[21]。另外一種是從蠶絲纖維出發,將蠶絲纖維直接通過“攪拌球磨”[46]或“氣流粉碎碾磨”[47]等方式獲得粒徑較大、β-折疊含量較高(>60%)的SF微米顆粒,但形貌規整性差,顆粒之間黏連嚴重,粒徑分布范圍較廣。除了機械粉碎法外,“從小到大”和“從大到小”的形成原理有關鍵共同點,先選擇合適的分散劑促使SF分子形成納米晶核或者液滴,再通過外界刺激誘導SF分子構象進一步發生轉變,形成水不溶的β-折疊,進而賦予SF納微米球良好的穩定性和分散性。

2.3 制備方法優缺點比較

在SF納微米球形成原理分類的基礎上,詳細比較了用于抗癌藥物遞送SF NPs的制備方法及各自的優缺點,如表1所示。靜電噴霧干燥、機械破碎及微乳法得到的是較大粒徑的SF微米顆粒(>1 μm),易被肺、肝臟、腎臟等器官代謝。而“從小到大”的鹽析法、反溶劑法,在制備方法、工藝參數及SF NPs的理化性能,對疏水性抗癌藥物的裝載及釋放等方面更具有優勢,因此在抗癌藥物裝載和遞送應用中研究較多[9,21]。

表1 不同方法制備絲蛋白納米顆粒的原理分類及優缺點Tab.1 Mechanism classification and merits and demerits of silk nanoparticles prepared by different methods

3 SF NPs理化性能對抗癌藥物療效的影響

SF NPs的尺寸、電荷分布、β-折疊含量、分散性、穩定性及化學可修飾性等性能,對抗癌藥物的選擇、裝載、釋放及療效均有至關重要的影響。

3.1 尺寸與電荷分布

在靶向納米顆粒的藥物遞送體系中,腫瘤組織中納米顆粒的含量及抗癌藥物對癌細胞的療效需重點考慮,而納米顆粒的尺寸是靶向體系中的關鍵控制因素。另外,納米顆粒的表面電荷對于細胞內化和抗癌藥物的遞送也具有重要作用。相比于帶正電荷的納米顆粒(非特異性吸附強,腎臟過濾快),帶負電荷和中性電荷的納米顆粒對延長血液循環耐受性及提升腫瘤吞噬和穿透能力更具有優勢[52]。Seib等[48]利用去溶劑法制備了粒徑為98 nm、電位為(-33.6±5.8) mV的SF NPs(PdI為0.109)。在此基礎上,通過靜電吸附將正電荷的阿霉素(Doxorubicin,Dox)裝載到負電荷的SF NPs中(Silk fibroin-doxorubicin nanoparticles,SF-Dox NPs,裝載量為40 ng/μg),裝載效率超過95%,且可通過pH值調控Dox的體外釋放速率(pH 4.5>6.0>7.4)。另外對MCF-7(人乳腺癌細胞)的體外研究表明,SF-Dox NPs相比于Dox的抗癌療效更顯著。Chen等[50]利用乙醇凍融法制備了粒徑分布為270～520 nm、電位為-17.0～-26.8 mV的絲蛋白-紫杉醇納米顆粒(Silk fibroin-paclitaxel nanoparticles,SF-Ptx NPs)。紫杉醇(Paclitaxel,Ptx)的包埋率和載藥率最高分別達到100%和6.9%,封裝率、載藥率、體外釋放速率受絲蛋白濃度、SF NPs的粒徑、絲蛋白β-折疊含量及Ptx的含量影響。在此研究基礎上,Wu等[53]制備了粒徑更小的SF-Ptx NPs(約130 nm),通過細胞毒性研究發現,相比于SF NPS,Ptx的加載增強了其對BGC-823、SGC-7901(胃癌細胞)的毒性。此外,SF-Ptx NPs在裸鼠體內抑制胃癌腫瘤生長和減少腫瘤質量的療效均優于Ptx。因此其基本規律是:在保證相同載藥量的前提下,SF NPs的粒徑小于100 nm更具有優勢。Wu等[54]進一步地聯合疏水性的Ptx和親水性的Dox兩種藥物,通過乙醇析出法制備了雙載藥SF NPs,通過改變再生絲蛋白溶液和乙醇的濃度進而調控載藥納米球的粒徑(100～600 nm),隨后將其通過靜脈注射應用于淋巴化療,研究發現雙載藥SF NPs中Ptx和Dox的藥物釋放可持續超過7 d。此外,雙載藥SF NPs可通過內吞作用表現出高細胞攝取。重要的是,相比于相同濃度的單一藥物SF NPs或游離藥物,雙載藥SF NPs在當Ptx/Dox比為1︰1時,表現出更高效的抑制HeLa(宮頸癌細胞)、HepG-2(肝癌細胞)生長。因此制備粒徑可控的雙載藥SF NPs可能對聯合化療具有重要的臨床意義。Rahmani等[55]利用丙酮析出法優化了制備負載5-氟尿嘧啶(5-Fu)的SF NPs的最佳配方(質量比為1︰1),粒徑和電位分別為220 nm和-32 mV時,包埋率和裝載率達到最高,分別為52.3%和34.3%,且體外釋放速率與5-Fu在SF NPs中的分布形式及相互作用(氫鍵、范德華力)有關。與游離藥物相比,SF-5-Fu NPs對MCF-7和HT-29(人結腸癌細胞)的毒性明顯增強。總而言之,SF NPs的尺寸及電荷分布直接決定其能否通過主被動靶向方式順利進入癌細胞內,是影響抗癌藥物療效發揮的核心指標。

3.2 β-折疊含量

通過改變pH值調控SF分子中的電荷分布,也能改變SF NPs中的β-折疊含量,進而調控抗癌藥物的裝載量和體內藥代釋放動力學[49]。SF中的疏水結晶區和親水無定形區可高效裝載親疏水性抗癌藥物,并提高疏水性抗癌藥物的水溶性,且SF NPs中無定形、Silk Ⅰ、Silk Ⅱ三者之間的比例可決定抗癌藥物的體內釋放速率。Coburn等[56]將Dox包埋在絲素蛋白膜中,并系統深入研究了不同結晶度絲蛋白膜對Dox體外釋放動力學的影響,研究結果證實了相比于結晶度低的絲蛋白膜,結晶度高的(高β-折疊含量)更能緩釋Dox,β-折疊含量高的絲蛋白膜更致密且擴散更慢,這也為后期制備裝載其他小分子抗癌藥物的SF NPs提供了研究思路。在此基礎上,Wu等[57]利用絲素蛋白的β-折疊結構與姜黃素的疏水性苯酚基團相互作用,制備了負載姜黃素的SF NPs,顯著提高了姜黃素的水溶性,使其口服生物利用度提高了17倍。

3.3 分散性及穩定性

SF NPs的分散性及穩定性對癌細胞的攝取有影響,其分散性和穩定性分別受電荷分布和肽段間氫鍵維系的β-折疊片層結構和二硫鍵等化學鍵的影響。Xiao等[58]優化了蠶絲的溶解體系,通過改變溴化鋰與甲酸的混合比例對脫膠絲進行溶解(維持絲蛋白分子間的弱氫鍵相互作用),經透析純化直接得到粒徑分布為100～200 nm、以無規卷曲為主要構象的絲蛋白納米顆粒(SNPs-F),分散性和穩定性比有機溶劑析出法(SNPs-A)進一步提升。Dox的裝載效率受兩者(絲蛋白與Dox)之間的比例調控(10%～100%),裝載量比前人進一步提高,達到100 ng/μg。另外,弱酸性條件(pH 4.5)可加快Dox的體外釋放(8 d累計釋放速率大于45%)。隨后,通過細胞攝取和毒性實驗研究發現,SNPs-F比SNPs-A更易被MCF-7細胞吞噬內化,且對癌細胞表現出更高的細胞毒性,這可能與納米顆粒的粒徑和穩定性(SNPs-F不易聚集)有關。Li等[59]利用去溶劑法制備平均粒徑為217 nm的含5-Fu和Cur雙藥的SF NPs,且5-Fu和Cur的裝載率分別為45%和15%。與游離5-Fu和Cur相比,裝載在SF NPs中的雙藥的生物利用度明顯提高。另外,當應用雙重載藥制劑時,可以增加活性氧水平,進而在體外誘導4T 1(乳腺癌細胞)凋亡。動物研究表明,注射該SF NPs制劑后,腫瘤可明顯減少。

3.4 化學可修飾性

SF NPs表面可修飾性是提高其靶向性的關鍵,經改性后的SF NPs具有很多優勢,包括提高SF NPs的穩定性,延長抗癌藥物的半衰期,提高抗癌藥物的生物利用度等。Wongpinyochit等[60]將PEG共價接枝到SF NPs表面上,提高SF NPs分散性和穩定性的同時,表現出高效的藥物負載能力(心得安封裝效率達到了93%)和持久的釋放能力(長達14 d),且對MCF-7細胞的抑制效果顯著(更有利于細胞攝取且積聚到溶酶體中)。進一步地,Hudit?等[61]將5-Fu負載在PEG修飾的SF NPs中,經靜脈注射研究發現,該遞送載體在降低5-Fu對正常血紅細胞毒性的同時可提高對HT-29腫瘤細胞的殺傷能力,能夠有效抑制腫瘤細胞遷移和侵襲潛力的影響。Yang等[62]制備了粒徑為140nm,且負載吲哚菁綠(Indocyanine green,ICG)和阿霉素的SF NPs,ICG是一種臨床認可的光敏劑。它是熱療治療中的一種光熱輔助劑,可使體內癌細胞的熒光可視化。此外,顆粒表面被MnO2礦化(SF@MnO2/ICG/Dox)。在近紅外(NIR)照射下,與未使用NIR的阿霉素釋放相比,表現出強烈而可控的光熱反應和快速藥物釋放。隨后利用SF@MnO2/ICG/Dox對4T1乳腺腫瘤小鼠進行照射后,與未照射的SF@MnO2/ICG/Dox顆粒或激光治療的游離Dox或ICG相比,小鼠腫瘤大小明顯減小,且生存期提高,表現出良好的抗腫瘤療效。

4 在抗癌藥物遞送中的研究進展

4.1 被動靶向遞送

被動靶向是指納米顆粒可根據實體瘤組織與正常組織的微血管結構不同(腫瘤組織主要表現為血管充血、血管結構異常、淋巴管引流不足),引起自發滯留,或作為異物被免疫系統中的巨噬細胞吞噬等途徑進入腫瘤細胞中的一種不自主行為。受到該作用機制啟發,充分利用腫瘤微環境促使SF NPs透過內皮富集作用,滲透至腫瘤組織內部,為抗癌藥物長時間釋放爭取更多時間,提高抗癌療效。Gupta等[63]通過毛細管微點法分別制備了粒徑小于100 nm的負載姜黃素(Curcumin,Cur)的SF和SF殼聚糖共混物的納米顆粒(SF-Cur NPs和SF/CS-Cur NPs)。相比于SF/CS-Cur NPs,SF-Cur NPs的裝載效率(>90%)和釋放量均最高(0.32～0.68 μg),且使MCF-7和MDA-MB-453的細胞活力明顯降低。該研究結果表明,SF-Cur NPs對乳腺癌細胞顯示出更高的療效并可作為體內乳腺腫瘤長效治療的遞送載體。Montalbán等[64]采用物理吸附法和共沉淀法分別制備了平均粒徑為166 nm和171 nm的SF-Cur NPs。對Hep3B(人肝癌細胞)和Kelly均具有細胞毒性,同時不會降低hBMSCs(人骨髓間充質干細胞)的活力。另外,SF-Cur NPs在對Kelly的細胞毒性方面表現出比Hep3B更高的療效。Xie等[65]利用超臨界CO2溶液增強分散(SEDS)制備了粒徑可控的SF-Cur NPs(<100 nm)。與游離的5-Fu相比,質量濃度高于10 μg/mL的SF-Cur NPs對 HCT-116(結腸癌細胞)顯示出更強的抗癌作用(>94%),抗癌機制可能與誘導凋亡細胞相關的G0/G1和G1/M期的細胞周期停滯有關。另外,在相同質量濃度下,與5-Fu相比,SF-Cur NPs對NCM-460(正常結腸細胞)的毒副作用降低。上述研究均證實了SF NPs在抗癌藥物的遞送過程中具有增強其被動靶向的能力。進一步地,為了延長SF NPs在血液中的循環時間,避免SF NPs與血漿蛋白發生非特異性吸附,Wongpinyochit等[60]通過丙酮析出法制備了SF NPs,并利用聚乙二醇(PEG)對其表面進行修飾,盡可能使更多納米顆粒經被動靶向進入腫瘤組織。研究結果證實,相比于SF NPs,經PEG修飾的SF NPs的電位發生明顯升高(從-56 mV增加到-47 mV),一方面提高了其在水中的分散性和穩定性(28 d),另外一方面在酸性條件下(pH 4.5),提高了Dox的釋放量(14 d內提高2倍)。經PEG修飾的SF NPs能被MCF-7高效吞噬,表現出更強的抗癌活性。因此對納米顆粒表面改性增強其被動靶向能力,延長其血液循環時間并持續發揮抗癌藥物療效是開發納米藥物載體的有效策略。另外,將對光、熱、磁場、電場、超聲波等具有刺激響應的物質裝載在SF NPs中,提高其被動靶向的能力和含量,從而實現抗癌藥物的精準遞送和高效治療,是目前納米腫瘤新制劑的研究熱點[66]。如將磁性的氧化鐵或四氧化三鐵和抗癌藥物裝載在SF NPs形成穩定的藥物劑型,靜脈注射后在外磁場的作用下使納米顆粒順利通過血液循環到達并富集在腫瘤組織部位,然后改變藥物的釋放外環境,包括調控酶的活性,改變pH、滲透壓及溫度等生理條件,使抗癌藥物在腫瘤組織中緩慢釋放[67]。Song等[68]利用鹽析法制備了具有磁性的SF-Cur NPs,對MDA-MB-231進行研究發現,具有磁性的小粒徑的SF-Cur NPs(90 nm)中Cur的細胞攝取明顯高于大粒徑的SF-Cur NPs(350 nm)和游離姜黃素(高達80%),且明顯降低了MDA-MB-231的活性。因此,具有磁性的SF-Cur NPs提供了外部進行癌癥靶向的可能性。

4.2 主動靶向遞送

被動靶向遞送最大的挑戰是SF NPs無法實現在癌變組織中的高濃度富集,且無法到達組織深處,藥物療效難以充分發揮。近十年中的被動靶向遞送研究數據表明,僅有0.7%的納米抗癌藥物制劑有效也充分佐證了這點[69]。將特異性配體或抗體通過化學修飾到SF NPs的表面使之對腫瘤組織具有更好的主動靶向性是SF納米抗癌制劑當前研究的重點方向。目前在SF NPs中應用較多的靶向分子配體包括葉酸,RGD多肽,乳鐵蛋白、透明質酸等。為了對癌細胞提供特異性識別,可提高SF NPs的主動靶向性。Subia等[70]通過丙酮析出法先制備了SF NPs,再將葉酸(Folic acid,FA)通過共價接枝到SF NPs表面,然后將Dox物理吸附得到粒徑小于200 nm的FA-SF NPs-Dox,在酸性條件下持久釋放長達21 d。與非功能化的SF NPs-Dox相比,經FA修飾的SF NPs-Dox的主動靶向能力增強,能被MDA-MB-231細胞高效內化吸收,且釋放的Dox顯著降低了癌細胞活力。考慮到Dox的藥物劑量低,難以持續發揮抗癌療效,進一步地,Sun等[71]首先通過鹽析法制備了負載Dox的SF NPs(SF NPs-Dox),再將FA通過共價接枝到(FA-SF NPs-Dox)的表面,作為腫瘤細胞葉酸受體的靶標。此外,相比于FA-SF NPs-Dox((19.63±0.27) μg/mg),二次物理裝載Dox的納米顆粒(FA-SF NPs-Dox-Dox)的載藥能力提升到(30.71±0.41) μg/mg,且依然具有球形多孔結構(粒徑約為530 nm,孔徑為17.84 nm)。體外釋放結果表明,低pH值、高離子強度及高酶濃度均可加快Dox從FA-SF NPs-Dox-Dox中釋放(30 h)。此外,與SF NPs-Dox-Dox相比,FA-SF NPs-Dox-Dox可加快被HeLa內化,且對HeLa具有更高的細胞毒性。iRGD是一種環狀的腫瘤歸巢肽,可增加腫瘤組織微環境中的血管和組織通透性。Bian等[72]通過反溶劑法誘導SF自組裝制得負載Ptx的納米顆粒(Ptx-SF-NPs),隨后用碳二亞胺將納米顆粒與抗表皮生長因子(Epidermal growth factor receptor,EGFR)-iRGD納米體進行耦聯結合(A-Ptx-SF-NPs)。經功能化的A-Ptx-SF-NPs平均尺寸約為186 nm。藥物包封率和載藥率分別為52%和10%。動物體內影像學結果表明,與非耦聯的Ptx-SF-NPs相比,A-Ptx-SF-NPs能顯著抑制HeLa癌細胞中EGFR的高表達。Roy等[73]通過斬切、碾磨和噴霧干燥等步驟制得載乳鐵蛋白的SF NPs。與純SF NPs相比,載乳鐵蛋白的SF NPs在MDA-MB-231和MCF-7細胞內的內化率顯著升高。Gou等[74]將具有線粒體靶向功能的IGC類似物(NIR770)和阿霉素通過鹽析法裝載在SF NPs中,并利用透明質酸(HA)對其表面進行功能化修飾。通過細胞吞噬實驗發現,與表面未經HA修飾的SF NPs-Dox相比,腫瘤細胞對HA表面修飾Dox納米顆粒(HDNPs)具有更高的吞噬效率。而當在培養基中加入游離HA分子后,細胞對HDNPs的吞噬效率顯著下降。綜合表明,SF NPs表面具有豐富的反應位點,可為靶向分子共價耦聯或化學修飾創造有利條件,便于納米抗癌制劑的主動靶向遞送和高效治療。

5 結 論

絲蛋白具有生物相容性優異、生物安全性高、免疫原性低、可塑性強等優勢,是制備納米藥物遞送載體的理想材料來源。腫瘤組織比較復雜,僅將SF NPs作為抗癌藥物的被動靶向遞送載體,療效甚微。而SF NPs的制備方法簡單,其尺寸、電荷、β-折疊含量、分散性、穩定性可控,尤其是其表面具有豐富的活性位點,可為特異性配體或抗體、抗癌藥物等通過共價耦聯或化學修飾創造有利條件,使之對腫瘤組織具有更好的主動靶向性和抗癌療效。因此,經功能化修飾的SF NPs在延長血液循環耐受性、腫瘤細胞吞噬、向腫瘤組織深層次穿透及對抗癌藥物的精準遞送和提高療效等方面,都展現出良好的應用前景。

盡管SF NPs具有諸多優勢,但其在納米抗癌藥物遞送體系的靶向治療研究處于起步階段,仍面臨著制備方法受到外源因素制約,且100 nm以下尺寸較難控制,結構不夠穩定,難以在靶向組織中富集,藥物有效治療濃度持續時間短,療效差等問題。因此科研工作者需在開發功能化、智能化SF NPs的制備技術、提升其理化性能(粒徑可控、穩定性優異、載藥量高效、靶向性準確)及抗癌療效(精準、長效、可控)等方面進行大量探索與研究。

《絲綢》官網下載

中國知網下載