基于TMT標記蛋白質組學技術研究接裝紙賦甜對唾液蛋白表達的影響

楊 月，劉夢夢，張 媛，伍鵬霖，董卉林，吳昌健，陳 蕊，朱懷遠，曹 毅

江蘇中煙工業有限責任公司，南京市建鄴區興隆大街29 號 210019

為滿足消費者對煙草制品感官舒適性方面的需求，卷煙工業企業通常采用賦甜的方式增強煙草制品的甜味感，使煙氣更加柔和、細膩，從而提高煙草制品的感官品質。其中，在接裝紙上施加甜味成分是較為常見的賦甜方式［1］。研究表明，卷煙抽吸過程中口腔感受到的甜味能夠增加甜潤感和生津感，使煙氣柔和細膩，有效降低刺激性，改善卷煙感官質量，從而給消費者帶來愉悅感和舒適性［2］。人體唾液是由口腔腺體分泌產生的混合液，具有潤滑、輔助消化和抗菌等諸多作用。唾液中包含DNA、RNA和蛋白質信息、代謝產物以及多種微生物，對于口腔疾病、腫瘤以及其他系統疾病的診斷具有巨大的應用價值［3］。由于各種生理病理狀態均有相關蛋白的參與，因此對唾液蛋白的功能及其分泌的分子機制研究有利于生理狀態和各種疾病的診斷［4］。

近年來，蛋白質組學技術的發展為唾液蛋白質的鑒定奠定了基礎。蛋白質組學（Proteomics）是以蛋白質為研究對象，高通量系統化解析蛋白質組成、功能及相互作用的科學。蛋白質是生命活動的承擔者，蛋白質組學能夠從蛋白水平上揭示研究對象的生理狀態、病理狀態等過程的作用機制［5］。隨著質譜儀器的發展，基于質譜技術的蛋白質組學定量技術得到了廣泛應用，目前蛋白質組學技術在煙草領域主要應用于煙草中蛋白質表達差異的分析［6-8］，但是尚未有通過唾液蛋白質組差異評價抽吸卷煙后人體感官感受方面的研究。為此，本研究中采用基于二級譜（MS2）定量的串聯質譜標簽（Tandem mass tag，TMT）標記的定量蛋白質組學技術對接裝紙賦甜卷煙及同規格未賦甜卷煙抽吸前后的差異蛋白進行鑒定，旨在從分子水平客觀評價卷煙賦甜技術對人體產生的生理影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

接裝紙不含甜味劑的卷煙，同規格（葉組配方、香精香料以及卷煙輔材均一致）接裝紙施加甜味劑的卷煙（江蘇中煙工業有限責任公司提供）。

尿素（≥98%）、乙二胺四乙酸（≥98.5%）、三氟乙酸（≥99%）、蔗糖（99%）、氯化鉀（99%）、碘乙酰胺（≥99%）和氫氧化鈉（≥98%）（德國Sigma公司）；十二烷基硫酸鈉（95%）、羥甲基氨基甲烷（99%）、二硫蘇糖醇（≥97%）、甘氨酸（＞99%）、丙烯酰胺凝膠（30%）和丙烯酰胺凝膠促凝劑（≥99%）（北京索萊寶科技有限公司）；鹽酸、丙酮（AR，北京化工廠有限責任公司）；二維蛋白定量試劑盒（美國GE Healthcare公司）；TMT試劑盒（美國Pierce公司）。

Ultimate RSLCnano 3000超高效液相色譜儀（美國 Dionex 公 司）；Sep-Pak C18色 譜 柱（美 國Phenomenex 公司）；Q Exactive HF 四極桿軌道阱質譜儀、Pico21 常溫離心機（美國Thermo Scientific 公司）；LC20AD 高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；5430R 冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；1645050 型垂直板電泳儀（美國Bio-rad 公司）；PB-10pH 計、BSA224S-CW 電子天平（感量0.000 1 g）（德國Sartorius 公司）；Biopette 微量移液器（10、100和1 000 μL，美國Labnet公司）；WD-2102A全自動酶標儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 唾液樣本的采集與處理

（1）唾液樣本的采集。分別采集6名35～55歲之間被試者（沒有糖尿病、自身免疫性疾病或暴露于放射或化學療法的病史）［9］在自然狀態下不抽煙（對照組，KB）、抽吸賦甜卷煙（賦甜卷煙組，SK-A）后5 min 以及抽吸同規格未賦甜卷煙（未賦甜卷煙組，SK-B）后5 min 的唾液樣本2 mL，樣品依次標記為KB-1～KB-6、SK-A1～SK-A6、SK-B1～SK-B6。 抽吸賦甜卷煙和未賦甜卷煙時間間隔2 h，期間被試人員保持靜息狀態，所有唾液樣本均在-20 ℃下保存。

（2）唾液蛋白的提取及酶解。向樣品中加入裂解液［2.5%十二烷基硫酸鈉，0.1 mol/L 羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl，用鹽酸調節0.1 mol/L 羥甲基氨基甲烷至溶液pH=8.0），1%蛋白酶抑制劑混合物］充分混合均勻，冰水浴超聲10 min，4 ℃條件下14 000 r/min 離心10 min，取上清液。利用丙酮沉淀法沉淀蛋白，向沉淀中加入8 mol/L 尿素溶液（pH=8.0）溶解沉淀，然后加入二硫蘇糖醇至終濃度為15 mmol/L，37 ℃孵育1 h。隨后加入碘乙酰胺至終濃度為30 mmol/L，室溫避光進行烷基化反應。Bradford法對蛋白定量，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。向樣品中加入0.1 mol/L Tris-HCl 溶液（pH=8.0），將尿素濃度稀釋至2 mol/L以下，按m胰蛋白酶：m蛋白=1∶50加酶，37 ℃孵育過夜。接著加入三氟乙酸終止反應，并將溶液pH 值調至6.0左右，12 000 r/min 離心15 min，取上清液經Sep-Pak C18柱進行脫鹽處理，收集濾液并用離心濃縮儀將溶劑完全揮發，干物質在-20 ℃下保存。

1.2.2 TMT標記及LC-MS/MS分析檢測

取等量的樣品進行TMT 標記（詳細步驟參照TMT 生產廠家說明書）。將等量混合標記后的樣品于14 000 r/min 條件下離心5 min，將上清液上樣至Sep-Pak C18柱上，并利用高pH反相色譜分離法對混合樣品進行分級分離，最終合并為15個組分，真空干燥后在-80 ℃下保存。測定前將每個樣本溶于0.1%甲酸中，14 000 r/min 離心5 min，將上清液轉移至色譜瓶中進行LC-MS/MS 分析。分析條件：

對肽段樣品通過自動進樣器取樣并結合至C18捕獲柱，洗脫至分析柱（75 μm × 250 mm，粒徑2 μm，孔徑100 ?，Acclaim PepMap C18柱）進行分離。利用兩個流動相（流動相A：0.1%甲酸；流動相B：0.1%甲酸+80%乙腈）建立100 min 的分析梯度（5%B 0 min，5% ～23%B 65 min，23% ～52%B 20 min，52% ～80%B 1 min，80%B 4 min，80% ～5%B 0.1 min，5%B 9.9 min），液相流速為300 μL/min。數據依賴型串聯質譜（DDA，Data dependent acquisition）模式分析時，每個掃描循環中包含一個MS全掃描（R=60 K，AGC=106，max IT=50 ms，質量掃描范圍350 ～1 800 amu），以及隨后的 20 個 MS/MS 掃描（R=30 K，AGC =5×104，max IT=200 ms）。碰撞能量設置為26 eV。四極桿的篩選窗口設置為1.2 Da。離子重復采集的動態排除時間設置為40 s。

1.2.3 生物信息學分析

以人的蛋白質組（Homo_sapiens_9606_UP_20210128.fasta）作為參考數據庫對質譜數據進行檢索，以蛋白和肽段水平1% 偽發現率（FDR，False discovery rate）為標準進行篩選。根據差異倍數＞1.2 或＜0.83 篩選差異蛋白，并進行T 檢驗（P＜0.05），得到組間顯著差異的蛋白質。利用Gene Ontology（GO）數據庫（www.geneontology.org）對鑒定到的蛋白質進行功能注釋和富集分析，GO 分為分子功能、細胞組分和生物過程［10］。利用真核生物亞細胞定位軟件WoLF PSORT 對差異蛋白進行亞細胞定位預測。利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數據庫（www.genome.jp/kegg/）確定差異蛋白參與的代謝通路［11］。

2 結果與分析

2.1 差異蛋白的鑒定

自然狀態下未抽吸對照組、抽吸賦甜卷煙以及抽吸同規格未賦甜卷煙3 個組的唾液，每組6 個樣本，共計18個樣本。通過數據庫檢索對蛋白質進行鑒定，從表1可見，共獲得764 583個二級譜圖，鑒定肽段匹配得到的譜圖共29 481個，總肽段數有8 440個，特異肽段數有1 033個，蛋白質總數2 099個。從KB、SK-A和SK-B組中均鑒定到了2 042個蛋白質組分。

表1 唾液樣品蛋白質鑒定結果Tab.1 Protein identification results from saliva samples

根據差異倍數＞1.2 或＜0.83 且 P＜0.05 為標準篩選差異蛋白（顯著上調表達蛋白和顯著下調表達蛋白）。如圖1a所示，與自然狀態下對照組唾液中的蛋白相比，賦甜卷煙組中鑒定到的差異蛋白數為5個，其中，上調表達蛋白4個，下調表達蛋白1個；與對照組相比，未賦甜卷煙組中鑒定到的差異蛋白數為107個，其中，上調表達蛋白102 個，下調表達蛋白5 個。可見，賦甜卷煙組唾液中鑒定到的差異蛋白數量明顯減少。同時對鑒定到的差異蛋白進行比較，得到1個在兩組中同時上調表達的蛋白，1個共同下調表達的蛋白以及在各組中特異表達的蛋白。另外，分析未賦甜卷煙組與賦甜卷煙組差異蛋白，共鑒定到59個，其中，上調表達蛋白55個，下調表達蛋白4個（圖1b），說明賦甜卷煙組和未賦甜卷煙組唾液蛋白存在較大差異。以上結果表明口腔受到未賦甜卷煙煙氣的刺激后，引起較多蛋白的快速表達以響應口腔環境的變化；而抽吸賦甜卷煙后，甜味的攝入減弱了人體對煙氣的刺激性感受，從而唾液中蛋白質組的變化較小，人體的感官感受更加舒適。

圖1 未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組唾液差異蛋白比較Fig.1 Differential proteins in saliva samples between groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

2.2 差異蛋白的富集分析

2.2.1 GO 富集分析以及亞細胞定位預測

將賦甜卷煙組和未賦甜卷煙組中鑒定的差異蛋白進行GO 富集分析，主要包括生物過程、分子功能和細胞組分方面。SK-B vs SK-A 中59 個差異蛋白的GO 富集分析結果（圖2）顯示，在細胞組分方面這些差異蛋白主要位于內膜系統、膜封閉腔、細胞器腔、非膜界細胞器以及胞外域等組分中。在分子功能方面主要與酸類物質、離子等的結合相關，分為金屬離子結合、DNA 結合、鋅離子結合、羧酸結合、有機酸結合以及微管結合等方面。在生物學過程方面主要與免疫、物質運輸以及響應外界刺激相關，分為免疫系統過程、免疫響應、正調節細胞過程、囊泡介導的運輸、細胞對化學刺激的響應以及細胞分泌等方面。賦甜卷煙組和未賦甜卷煙組中鑒定的差異蛋白在生物過程、分子功能和細胞組分方面均存在較大的差異，表明在接裝紙上施加甜味劑能夠顯著改善人體抽吸卷煙時唾液中應激蛋白的表達及組成。

圖2 未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組差異蛋白的GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of differential proteins in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

亞細胞定位預測結果顯示，未賦甜卷煙組與賦甜卷煙組中59 個差異蛋白主要定位于細胞質（48%）、胞外（19%）、線粒體（18%）、核（13%）以及細胞骨架（3%）部位（圖3）。

圖3 未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組差異蛋白的亞細胞定位預測結果Fig.3 Predicted subcellular localizations of differential proteins in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

2.2.2 KEGG 富集分析

分別將賦甜卷煙組和未賦甜卷煙組鑒定的59個差異蛋白進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因和基因組數據庫）代謝通路分析。如圖4 所示，這些差異蛋白主要參與代謝途徑、次生代謝物的生物合成、不同環境下的微生物代謝、藥物代謝其他酶、松弛素信號通路、嘌呤代謝以及趨化因子信號通路等代謝通路。KEGG代謝通路分析結果表明，未賦甜卷煙組與賦甜卷煙組唾液中鑒定的差異蛋白參與到不同代謝通路中。

圖4 未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組差異蛋白的KEGG 通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis of differential proteins in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

3 討論

利用蛋白質組學技術鑒定賦甜卷煙組唾液和未賦甜卷煙組唾液中的差異表達蛋白，有助于從分子生物學的角度解析接裝紙賦甜技術對消費者抽吸卷煙后感官的影響。本研究中通過對抽吸賦甜卷煙唾液和抽吸同規格未賦甜卷煙唾液中的差異蛋白進行鑒定和分析，結合GO 富集分析和功能注釋，進一步解析賦甜卷煙對人體的影響。從生物學過程的角度，在抽吸未賦甜卷煙和賦甜卷煙消費者唾液中共鑒定到與刺激響應相關的差異蛋白9個，差異蛋白的詳細信息如表2所示。這些蛋白所表現的刺激響應類別主要有刺激響應、非生物刺激響應、外部刺激響應、細胞刺激響應和對外部刺激響應的調節等。這些刺激響應蛋白在未賦甜卷煙組唾液中顯著上調表達，在賦甜卷煙組唾液中表達量顯著降低，表明在接裝紙上施加甜味劑能夠顯著減少抽吸卷煙時煙氣對口腔的刺激。這種生物功能上的刺激既包括卷煙感官評價方法中的煙氣刺激性，也包括煙氣對人體產生的輕松感、滿足感以及舒適感。研究表明，甜味感知取決于舌頭上的兩個G 蛋白偶聯亞基受體T1R2和T1R3［12-13］，人通過攝入富含甜味劑的飲食刺激這些受體，就會產生愉悅感［14-15］。同理，消費者在抽吸接裝紙賦甜卷煙時，口腔可直接感受甜味劑帶來的甜感，弱化因煙氣刺激、干燥以及收斂所帶來的口腔不適，從而感覺更加愉悅和舒適。這種分子生物學上的差異也從客觀上佐證了卷煙接裝紙賦甜有利于提升卷煙的感官品質。

從分子功能的角度分析，與抽吸賦甜卷煙相比，抽吸未賦甜卷煙組唾液中的3 個上調表達蛋白（O00602、P05109和P06702）表現出與有機酸結合的特性（圖2），其中，P05109和P06702與刺激響應相關（表2）。有機酸與卷煙吸味品質密切相關，煙氣中的有機酸一方面能夠產生酸香香韻，另一方面與卷煙煙氣的口感特征如收斂感和干燥感密切相關［16］。在乳清蛋白飲料中，pH過低會引起口腔明顯的收斂感［17］，這種收斂感的產生主要是酸性物質與唾液蛋白形成不溶沉淀物，導致口腔潤滑性降低［18］。未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組差異蛋白與有機酸結合的同時也能響應刺激，表明煙氣中的有機酸可能會導致口腔的收斂感和刺激感增強，而這2個差異蛋白在未賦甜卷煙組唾液中顯著上調表達，在賦甜卷煙組唾液中表達顯著降低，表明接裝紙上施加的甜味劑能夠明顯減少由有機酸引起的口腔刺激。

從KEGG 通路角度，抽吸未賦甜卷煙組唾液中的 5 個 上 調 表 達 蛋 白（P06733、A0A024R7R1、A0A140VK56、B4DFP1 和 V9HVZ4）參與不同環境下的微生物代謝通路（表2，表3）。而賦甜卷煙因在接裝紙中施加了甜味劑，也有可能影響口腔微生物的代謝。目前已有研究報道煙氣對口腔微生物環境的影響［19-20］，但對于接裝紙中甜味劑的施加是否能夠改善微生物種群結構有待進一步研究。

表3 不同環境下的微生物代謝通路相關差異蛋白的鑒定和分析Tab.3 Identification and analysis of differential proteins in the pathway of microbial metabolism in diverse environments

賦甜卷煙組和未賦甜卷煙組的差異蛋白中，A8MX94 屬于谷胱甘肽巰基轉移酶（GSTP1），定位于細胞質，具有谷胱甘肽轉移酶活性，參與谷胱甘肽代謝過程（表4）。有報道表明，在急性社會心理壓力后口腔唾液中的谷胱甘肽巰基轉移酶表達明顯升高［21-22］，GSTP1在未賦甜卷煙組唾液表達顯著升高，在賦甜卷煙組表達降低，說明抽吸賦甜接裝紙卷煙在舒緩情緒、減少心理壓力方面效果顯著。另外，在這些差異蛋白中，P05109、P06702 和 P80511 分別是S100-A8、S100-A9 和 S100-A12 蛋白（表 2），屬于S100家族的Ca2+結合蛋白，在調節炎癥和免疫反應中起重要作用［23］，有越來越多的研究［24-26］表明社會心理因素會影響S100 蛋白的水平。一項臨床前小鼠模型的研究發現，腎上腺素、去甲腎上腺素、皮質醇和血清素等應激激素可誘導 S100-A8 和S100-A9 的快速釋放［24］；另一項研究發現乳腺癌患者的焦慮、抑郁和社會幸福感得分與唾液S100-A8和S100-A9水平顯著負相關［25］。未賦甜卷煙組唾液S100-A8、S100-A9 和 S100-A12 的表達水平顯著高于賦甜卷煙組，同樣也說明卷煙接裝紙中甜味劑的釋放對吸煙者的情緒能夠起到較好的舒緩作用，使之處于一種輕松的狀態，從而有效提升吸煙者的愉悅感。

表2 與未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組刺激響應相關的差異蛋白Tab.2 Differential proteins associated with stimulus response in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

表4 未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組差異蛋白A8MX94 的鑒定和分析Tab.4 Identification and analysis of differential protein A8MX94 in groups smoking cigarettes with unsweetened tipping paper and sweetened tipping paper

4 結論

①通過TMT標記的定量蛋白質組學技術，在未賦甜卷煙組和賦甜卷煙組中鑒定的差異蛋白多達59個，在GO條目中刺激響應相關的生物過程以及與有機酸結合的分子功能等顯著富集；②在抽吸未賦甜卷煙過程中，煙氣中有機酸類等物質對口腔產生刺激，引起與有機酸結合相關蛋白的顯著上調表達，表明其對口腔的刺激較為明顯；③在抽吸接裝紙賦甜卷煙時，口腔可直接感受甜味劑帶來的甜感，弱化因煙氣刺激、干燥以及收斂所帶來的口腔不適，因此該組唾液中差異蛋白的數量顯著減少，刺激響應相關蛋白的表達水平顯著降低，從而感覺更加愉悅和舒適，從分子生物學角度客觀反映了接裝紙賦甜技術有利于提升卷煙感官品質。