雪茄煙中霉菌計數方法的適用性評價

黃 闊，葉長文，李東亮，李青常，朱貝貝，劉萌萌，范 黎，史占東，薛 芳*，李 棟*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 四川中煙工業有限責任公司，成都市成龍大道一段56 號 610066

霉變是煙草及煙草制品存儲中需要重點研究解決的關鍵問題之一［1-3］，霉變除影響煙草及煙草制品感官品質外還可能造成嚴重的經濟損失［1，4-6］。雪茄煙與傳統卷煙相比，更易發生霉變［7］，而預防和控制雪茄煙霉變的前提是能夠快速準確地檢測雪茄煙中的霉菌含量，評估雪茄煙霉變發生的風險。由于雪茄煙生產及存儲的特殊性和霉菌的差異性，尋找更加適合于雪茄煙中霉菌計數的方法尤為重要。

國內外食品行業出臺了霉菌計數相關標準檢測方法，如ISO 21527—2：2008［8］、GB 4789.15—2016［9］和美國FDA 官方檢測方法［10］等，這些微生物學霉菌計數方法主要采用孟加拉紅瓊脂培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，推薦使用平板傾注法或平板涂布法兩種接種方式［8-12］。煙草行業也參考食品相關檢測方法建立了煙草及煙草制品中霉菌計數方法標準［11］，采用改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基進行平板傾注法接種。林華清等［13］針對煙草及煙草制品中8種常見霉菌，對霉菌計數用培養基種類進行了篩選，但未對實際煙草樣品進行適用性驗證和分析。由于不同類型煙草及煙草制品中霉菌種類較多且存在差異性，同時培養基種類和接種方式也直接影響計數結果的準確性，若在同等條件下將樣品中的霉菌盡可能多地培養出來，有必要對適宜的培養基種類進行系統比較和篩選，并優化接種方式，以得到穩定準確的檢測結果。為此，對目前的霉菌計數方法綜合分析后，選用孟加拉紅瓊脂培養基（GB 法推薦用培養基）、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（YC/T法推薦用培養基）和SYMPHONY Agar 快速顯色培養基（Biokar法推薦用培養基）等3種培養基，采用平板涂布法與平板傾注法兩種接種方式對國內市售13種雪茄煙進行霉菌計數，研究3種培養基在不同接種方式條件下雪茄煙中霉菌計數結果的差異性及霉菌形態的變化，并對各霉菌計數方法進行適用性評價，旨在為篩選出適宜雪茄煙的霉菌計數方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

從視覺、嗅覺的角度，根據雪茄煙的霉變程度，選擇國內市售13種具有代表性的雪茄煙（見表1）作為試驗樣品。13 個樣品按茄芯原料形態分類，分為煙束（8種）、煙片（4種）和煙絲（1種）三類；按制作方式分為手制（10 種）、半手制（1 種）和機制（2 種）三類；按包裝形式分為木盒（4種）、紙盒（7種）和鐵盒（2種）三類［14］。

表1 13種雪茄煙樣品基本信息Tab.1 Basic information of 13 cigar samples

1.2 儀器與試劑

Bagmixer?400均質器（法國Interscience公司）；HZT-2000電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；CL-40M高壓滅菌鍋（日本AUTOCLVAE公司）；SCAN 1200自動菌落計數器（法國Interscience公司）；VORTEX 1 渦旋振蕩器（德國 IKA 公司）；CTHI-250B2恒溫恒濕箱（上海施都凱儀器設備有限公司）。

孟加拉紅瓊脂培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（按照煙草行業標準［11］制備）；SYMPHONY Agar快速顯色培養基（法國Solabia集團Biokar公司）；225 mL磷酸鹽緩沖液、無菌培養皿、無菌L型涂布棒、無菌均質袋（廣東環凱微生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品稀釋

每個樣品各稱取25 g，用無菌剪刀剪碎，置于無菌均質袋中，加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液，均質器3擋均質3 min，取均質后樣液梯度稀釋，按照前期對樣品中霉菌含量的評估，依次制備4 個稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4）。每個樣品3次重復，進行稀釋接種。

1.3.2 接種和培養

分別使用平板傾注法［15］和平板涂布法［8］在3 種培養基上進行平行試驗，最后對3種培養基及兩種接種方式進行比較。

平板傾注法（QZ）：先吸取1 mL 各樣品的梯度稀釋液于培養皿中，再將20 ～25 mL 45 ℃左右的高壓蒸汽滅菌后的培養基傾倒于培養皿中。然后沿同一時針方向輕微旋轉培養皿使樣品與培養基混合均勻，待培養基完全凝固后用封口膜密封，標記后置于恒溫恒濕培養箱內于28 ℃±1 ℃正置培養。其中GB法［9］與YC/T法［11］需培養至第5天，Biokar法需培養至第3天。

平板涂布法（TB）：吸取各樣品的梯度稀釋液于各培養基表面（每個稀釋度分別吸取0.333 mL 接種量并分別加入到3 塊已提前制備好的培養基平板中），后用一次性無菌L 型涂布棒涂抹均勻，待培養基表面水分晾干后密封進行正置培養，培養及計數方法與平板傾注法相同。具體技術路線及方法簡稱如圖1所示。

圖1 技術路線Fig.1 Technical route

1.3.3 霉菌判讀、計數及數據統計

按照各培養基特點直接肉眼觀察（必要時使用放大鏡）判別霉菌形態。

平板傾注法（最低檢出限10 CFU/g）霉菌計數公式：

式中：Qi為每個重復的霉菌菌落總數；i為重復次數；T為稀釋倍數。

平板涂布法（最低檢出限10 CFU/g）霉菌計數公式：

式中：Ti為每個重復的霉菌菌落總數；i為重復次數；T為稀釋倍數。

按照GB 4789.15—2016［9］進行霉菌菌落計數。

1.4 數據分析

使用Microsoft Excel 2010 軟件進行數據整理，將所檢測霉菌計數結果轉化為以10為底數的對數值（未檢出樣品的對數值按0.7 統計），采用SPSS 26.0軟件進行獨立樣本T 檢驗，評價各方法對霉菌計數結果的差異顯著性。

使用 Med Calc?Version 19.0.4 軟件繪制 Bland-Altman 圖，其基本原理是計算出兩方法測量結果的一致性界限，并以圖形方式直觀反映，同時根據實際測量結果判斷兩種方法是否具有一致性［16-18］。

2 結果與討論

2.1 霉菌計數方法比較

2.1.1 3種培養基平板涂布法的比較

對3 種培養基平板涂布法霉菌計數結果分別進行Bland-Altman圖比較，如圖2、圖3和圖4所示。將GB 法-TB、Biokar 法-TB 和 YC/T 法-TB 進行比較，發現除低濃度樣本中的個別數據分布在95%上下限之外，其余樣本占比分別為92.31%、92.31%和89.74%的數據點落在95%上下限內，說明3 種方法間檢測結果一致性較好。當樣品中霉菌含量低于102CFU/g 時，培養基對霉菌計數結果的影響較大，而當樣品中霉菌含量高于102CFU/g時，培養基對霉菌計數結果的一致性較好。表明3種培養基采用平板涂布法進行接種，對霉菌計數結果的影響與樣品中霉菌含量有關。

圖2 平板涂布法接種條件下GB法和YC/T法霉菌計數結果的一致性比較Fig.2 Result consistency between the GB and YC/T mould counting methods when adopting spread plate inoculation method

圖3 平板涂布法接種條件下GB法和Biokar法霉菌計數結果的一致性比較Fig.3 Result consistency between the GB and Biokar mould counting methods when adopting spread plate inoculation method

圖4 平板涂布法接種條件下Biokar法和YC/T法霉菌計數結果的一致性比較Fig.4 Result consistency between the Biokar and YC/T mould counting methods when adopting spread plate inoculation method

如圖5 所示，通過對A、B、C、D、E 等5 個樣品的菌落形態觀察發現，3種培養基采用平板涂布法接種培養后樣品中典型霉菌菌落形態區別較大，其中GB法與YC/T 法霉菌菌落較大，形態清晰易判讀。Biokar 法典型菌落較小，分布均勻，更有助于計數，但較難從菌落形態上區分出不同種類的霉菌，由此推測Biokar法所用SYMPHONY Agar快速顯色培養基中生長促進劑和選擇性系統既可以促進霉菌的快速生長又能抑制霉菌菌絲的過度繁殖。綜合比較發現，平板涂布法接種培養基上霉菌菌落全部生長于培養基表面，GB 法與YC/T 法的典型霉菌菌落形態最易判別，而Biokar法更易快速計數。

圖5 平板涂布法接種條件下3種培養基中霉菌的形態比較Fig.5 Morphological comparison of mould in three media with spread plate inoculation method

2.1.2 3種培養基的平板傾注法比較

對3種培養基的平板傾注法進行分析，結果如圖6、圖 7 和圖 8 所示。從 Bland-Altman 圖中發現，94.87%的數據點均落在95%上下限內，表明3 種培養基的平板傾注法結果一致性較好。檢測樣品中霉菌含量低于102CFU/g 時，3 種培養基在平板傾注法接種條件下與平板涂布法接種條件下表現出的霉菌計數結果一致。說明無論采用平板傾注法還是平板涂布法接種，當樣品中霉菌含量低于102CFU/g 時，各培養基所對應的計數方法均存在一定的波動性。

圖6 平板傾注法接種條件下GB法和YC/T法霉菌計數結果的一致性比較Fig.6 Result consistency between the GB and YC/T mould counting methods when adopting pour plate inoculation method

圖7 平板傾注法接種條件下GB法和Biokar法霉菌計數結果的一致性比較Fig.7 Result consistency between the GB and Biokar mould counting methods when adopting pour plate inoculation method

圖8 平板傾注法接種條件下Biokar法和YC/T法霉菌計數結果的一致性比較Fig.8 Result consistency between the Biokar and YC/T mould counting methods when adopting pour plate inoculation method

3 種培養基中平板傾注法對樣品中霉菌生長狀況的影響如圖9所示。平板傾注法與平板涂布法相比，霉菌菌落除生長于培養基表面外，還在培養基內部呈現出不同的立體生長形態。YC/T法和GB法菌落生長形態相似，部分霉菌生長速率過快，菌落易蔓延，相互交錯，影響計數。Biokar法霉菌生長速率較慢，更利于霉菌計數。

圖9 平板傾注法接種條件下3種培養基中霉菌的形態比較Fig.9 Morphological comparison of mould in three mediums with pour plate inoculation method

2.1.3 平板涂布法與平板傾注法的比較

GB 法（孟加拉紅瓊脂培養基）比較結果如圖10所示，各樣品在兩種接種方式下霉菌計數結果差異均在1 個數量級內。通過獨立樣本T 檢驗發現7 個樣品（A、B、D、E、G、I、J）的平板涂布法與平板傾注法之間存在顯著差異，其中3 個低、中濃度樣品（B、D、E）的平板涂布法檢測結果顯著高于平板傾注法，4個中、高濃度樣品（A、G、I、J）的平板傾注法檢測結果顯著高于平板涂布法。53.85%的樣品計數結果存在差異性，表明兩種接種方式間差異較大，對霉菌計數結果有較大影響。

圖10 GB法條件下平板涂布法和平板傾注法接種方式霉菌計數結果的差異性比較Fig.10 Comparison of mould counting results between spread and pour plate inoculation methods when adopting the GB method

YC/T 法（改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）比較結果如圖11所示。4個樣品（B、C、D、E）中平板涂布法與平板傾注法之間存在顯著差異，且3個中、高濃度樣品（B、C、D）的平板涂布法檢測結果顯著高于平板傾注法。30.77%的樣品計數結果存在差異，且主要表現為平板涂布法檢測結果高于平板傾注法，表明兩種接種方式間差異較小，對霉菌計數結果影響不大。

Biokar 法（SYMPHONY Agar 快速顯色培養基）比較結果如圖12 所示，僅有3 個樣品（B、C、L）的平板涂布法與平板傾注法之間存在顯著差異。23.08%的樣品計數結果呈現出差異性，且均表現為平板涂布法檢測結果高于平板傾注法，表明兩種接種方式間差異更小，對霉菌計數結果影響較小。

圖12 Biokar法條件下平板涂布法和平板傾注法霉菌計數結果的差異性比較Fig.12 Comparison of mould counting results between spread and pour plate inoculation methods when adopting the Biokar method

2.2 霉菌計數方法的比較

3 種霉菌計數方法及兩種接種方式綜合比較結果如表2所示。

表2 霉菌計數方法的比較Tab.2 Comparison of mould counting methods

培養基的選擇：平板涂布法接種適用于GB法推薦的孟加拉紅瓊脂培養基和Biokar 法推薦的SYMPHONY Agar 快速顯色培養基，平板傾注法接種更適用于YC/T 法所推薦的改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基。無論是霉菌計數結果還是霉菌生長形態，不同培養基的效果不同，在試驗研究過程中可以根據試驗目的選擇不同的培養基。

前期準備及操作步驟：不同計數方法和不同接種方式對于前期準備和操作步驟的要求不同。但各方法間對于平板傾注法接種的前期準備較為相似，均為將培養基在接種前進行水浴保溫，且各水浴溫度要求差異不大，但操作步驟繁瑣。各方法間對于平板涂布法接種的前期準備要求均為提前預制平板，操作步驟便捷。

培養時間：3種霉菌計數方法均為傳統微生物學檢測方法，由于霉菌生長的特殊性及樣品的差異性，各方法中對于培養時間的要求不盡相同。GB 法、YC/T 法和Biokar 法對培養時間的要求分別為5 d、2～5 d 和54 h～3 d，GB 法與其他兩種方法相比培養周期較長，不利于霉菌快速計數，Biokar法可以在更短的培養時間內實現對樣品中霉菌的計數。

菌落形態：根據圖5和圖9中霉菌生長形態的差異性，無論是培養基還是接種方式的不同，均會影響霉菌菌落形態的觀察，而培養基對霉菌形態的影響明顯大于接種方式。但無論平板涂布法還是平板傾注法接種方式，均表現出GB法所用孟加拉紅瓊脂培養基和YC/T 法所用改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基更有利于霉菌生長形態的觀察，而Biokar 法所用SYMPHONY Agar快速顯色培養基則更有利于霉菌計數。

判讀計數：影響樣品中霉菌判讀計數的因素較多，在培養基和接種方式明確的條件下，菌落生長速率和菌落分布均勻度對于判讀計數有重要影響。由于霉菌生長的特殊性，菌落生長速率較快不利于霉菌計數，稍不注意便會造成菌落蔓延而無法計數。3種培養基進行比較，孟加拉紅瓊脂培養基和改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基菌落生長速率較快，不利于霉菌計數，而SYMPHONY Agar 快速顯色培養基菌落生長速率較慢，有利于霉菌計數。除霉菌生長速率外，菌落分布均勻性也影響霉菌的判讀計數，而接種方式對于菌落分布的影響更大。平板傾注法接種并培養后，菌落分布不均勻且菌落還可能生長在培養基內部，而平板涂布法接種并培養后霉菌菌落在培養基表面分布均勻、更易于觀察與計數。

3 結論

①3種培養基在同種接種方式條件下，雪茄煙中霉菌計數結果的一致性較好，其中Biokar 法培養周期短，霉菌生長緩慢，可避免菌落快速蔓延，更利于計數，GB 法和YC/T 法則更適用于對霉菌菌落的形態觀察。②相同培養基在不同接種方式條件下，雪茄煙中霉菌計數結果存在差異。與平板傾注法相比，平板涂布法操作簡單，霉菌菌落均勻分布于培養基表面，適合大批量樣品檢測。