基于vWF/GPIb-IX-V信號通路的丹紅注射液對急性血瘀大鼠模型活血化瘀作用及機制研究

劉 旭，吳宿慧，陳小菲，張宇航，李寒冰*，唐進法*

基于vWF/GPIb-IX-V信號通路的丹紅注射液對急性血瘀大鼠模型活血化瘀作用及機制研究

劉 旭1，吳宿慧1，陳小菲2，張宇航1，李寒冰1*，唐進法2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中醫(yī)藥“治未病”健康重點實驗室，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省中藥臨床應(yīng)用、評價與轉(zhuǎn)化工程研究中心，河南 鄭州 450000

觀察丹紅注射液對急性血瘀大鼠模型的影響，探討丹紅注射液調(diào)控血瘀證血小板功能的作用機制。60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、舒血寧注射液（1.8 mL/kg）組和丹紅注射液高、中、低劑量（1.4、0.7、0.35 mL/kg）組，尾iv給予藥物干預(yù)11 d后，采用sc腎上腺素聯(lián)合冰水浴制備急性血瘀證大鼠模型，再給予藥物干預(yù)1 d后，檢測血流變指標(biāo)、凝血功能指標(biāo)，血小板活化黏附、聚集、釋放相關(guān)指標(biāo)；觀察耳廓微循環(huán)、心電圖和心尖、腹主動脈組織病理變化；采用qRT-PCR和Western blotting檢測心肌組織蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、p38、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）的表達。與空白組比較，模型組大鼠血液流變學(xué)、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、β-血栓環(huán)蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）、血小板第四因子（platelet factor 4，PF4）指標(biāo)顯著升高（＜0.05、0.01），6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α）、耳廓微循環(huán)血流量顯著降低（＜0.01），心肌組織p-Akt1、p-ERK1/2、p-p38蛋白表達以及、、基因表達水平均顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，丹紅注射液能夠不同程度地降低血液流變學(xué)指標(biāo)、vWF、FN、TXB2、β-TG、PF4（＜0.05、0.01），升高6-keto-PGF1α（＜0.05、0.01），顯著提高凝血酶時間（thrombin time，TT）值（＜0.05、0.01），保護心臟，增加耳廓微循環(huán)血流量（＜0.05）。心尖、腹主動脈組織HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌、血管內(nèi)膜出現(xiàn)輕微損傷，彈力纖維破壞，由于斑塊脫落導(dǎo)致開始出現(xiàn)空泡；丹紅注射液組大鼠心肌、血管內(nèi)膜和內(nèi)皮細胞以及彈力纖維顯著改善。丹紅注射液可以恢復(fù)血液流變學(xué)、凝血功能，改善血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞功能，通過調(diào)控vWF/GPIb-IX-V介導(dǎo)的信號通路及血小板功能，對大鼠急性血瘀有較好的保護和治療作用。

丹紅注射液；急性血瘀；心血管疾病；血小板功能；血管性血友病因子；表面受體糖蛋白Ib-IX-V

血瘀證為中醫(yī)常見證候，是瘀血內(nèi)阻，以疼痛、腫塊、出血、瘀血為主要表現(xiàn)的病證，凡離開經(jīng)脈之血不能及時消散和瘀滯于某一處，停留體內(nèi)使得血運不暢，或血流循行遲緩不流暢，郁積于經(jīng)脈或器官之內(nèi)呈凝滯狀態(tài)均為瘀血[1]。微循環(huán)障礙是血瘀證的基本病理變化和客觀指標(biāo)[2]，當(dāng)凝血功能出現(xiàn)障礙時，會造成明顯的微循環(huán)障礙，血流緩慢[3]。血小板的活化、聚集和釋放是造成血瘀的重要生理和病理基礎(chǔ)，血液在組織器官中呈瘀滯狀態(tài)[4]，血小板的活化、聚集、釋放等功能增強，均會使血液處于高凝狀態(tài)，血行不暢，形成血栓。血小板功能活化和瘀血最終都會導(dǎo)致血瘀證。血瘀會阻礙氣血運行，導(dǎo)致氣血運行緩慢，如果血瘀長期得不到有效的治療，會在局部形成腫塊。還會導(dǎo)致心臟供血不足，長此以往，會逐漸發(fā)展為冠心病，引起胸悶、疼痛等癥狀。現(xiàn)代研究表明血小板功能障礙是造成心血管疾病的重要因素之一，而且由于其調(diào)控機制復(fù)雜、藥物的作用靶點繁多等原因，目前關(guān)于血小板功能的相關(guān)研究已經(jīng)成為如何治療心血管疾病的關(guān)鍵。其中，中藥抗血小板的作用顯著[5]。

丹紅注射液是一種中藥注射劑，主要由丹參、紅花組成。丹參性苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效；紅花辛、溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效[6-8]；二者合用，是近代醫(yī)家常用的經(jīng)典藥對，常用于治療“胸痹”等心血管疾病[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹紅注射液具有抗凝[10]、抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、促血管新生的功效[11-12]，但其對治療血瘀和抗血小板功能的作用機制研究未見詳細報道，本課題組前期成功建立了基于抗凝血活性的丹紅注射液生物效價的測定方法，明確了丹紅注射液抗凝血活性可作為其質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)[13]，在此基礎(chǔ)上，本研究通過建立急性血瘀大鼠模型，在整體上探討丹紅注射液活血化瘀作用的特點，并圍繞抗凝和抗血小板功能，從分子水平上還原丹紅注射液治療血瘀及抗血小板功能的作用機制，為丹紅注射液臨床治療血瘀證及心血管疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量170～200 g，由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（浙）2019-0001，合格證號20211117Aazz0619000332。動物于標(biāo)準(zhǔn)化室溫（22±2）℃、相對濕度（55±5）%、12 h晝夜交替的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號DWLLGZR202202018）。

1.2 藥品與試劑

丹紅注射液（國藥準(zhǔn)字Z20026866，10 mL/支，批號21051006）購自山東丹紅制藥有限公司；舒血寧注射液（國藥準(zhǔn)字Z14021871，批號21061911，10 mL/支）購自朗致集團萬榮藥業(yè)有限公司；氯化鈉注射液（國藥準(zhǔn)字H41023828，批號A22040405A）購自河南科倫藥業(yè)有限公司；鹽酸腎上腺素注射液（國藥準(zhǔn)字H31021062，批號10210406，1 mL/支）購自上海禾豐制藥有限公司；戊巴比妥鈉（批號TP20160910）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；多聚甲醛（批號CR2103050）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）測定試劑盒（批號STY50201-48-5）、凝血酶時間（thrombin time，TT）測定試劑盒（批號STY50301-39-4）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）測定試劑盒（批號STY50101-38-3）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）測定試劑盒（批號STY50401-31-2）購自泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司；纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）ELISA試劑盒（批號Jul 2022）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）ELISA試劑盒（批號Jul 2022）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α）ELISA試劑盒（批號Jul 2022）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）ELISA試劑盒（批號Jul 2022）、β-血栓環(huán)蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）ELISA試劑盒（批號Jul 2022）、血小板第四因子（platelet factor 4，PF4）ELISA試劑盒（批號Jul 2022）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；山羊抗兔二抗（批號20000243）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）抗體（批號00107910）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）抗體（批號00095149）；p-ERK1/2抗體（批號00106696）、p-Akt1抗體（批號00092705）、p-p38抗體（批號00105889）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；p38抗體（批號26）購自美國CST公司；β-actin抗體（批號AA0718B8088ZJ2）購自Bioworld公司。

1.3 儀器

SW-CJ型超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；SC40型半自動凝血分析儀（泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司）；SD-100型動態(tài)血沉/壓積測試儀（北京賽科希德科技股份有限公司）；PeriFlux System 5000型激光多普勒微循環(huán)系統(tǒng)（瑞典百靈威Perimed公司）；BL420F型生理記錄儀（成都泰盟科技有限公司）；Fresco 17型高速冷凍離心機、QuantStudio 7 FleX實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDocTM MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)、PowerPac Universal電泳儀電源（美國Bio-Rad公司）；LabCycler型PCR擴增儀（SensoQuest公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為空白組、模型組、舒血寧注射液（1.8 mL/kg）組和丹紅注射液高、中、低劑量（1.4、0.7、0.35 mL/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的2、1、0.5倍）[14]組，每組10只。各給藥組每日9: 00時尾iv藥物，空白組和模型組尾iv等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥11 d后開始造模，空白組sc生理鹽水，其余各組sc鹽酸腎上腺素（0.8 mg/kg），2 h后將各組大鼠置于0～4 ℃冰水中游泳5 min，擦干背毛，2 h后再次sc鹽酸腎上腺素（0.8 mg/kg），造模后各組禁食不禁水12 h以復(fù)制急性血瘀模型。第12天給藥30 min后，ip 2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉，觀察耳廓微循環(huán)、心電圖；腹主動脈取血，檢測血液流變學(xué)指標(biāo)、凝血功能指標(biāo)，解剖后取心尖及以上1 cm組織、腹主動脈組織。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察

實驗期間，每天給予充足飼料及飲水，使各組大鼠體質(zhì)量呈穩(wěn)態(tài)增長，每日觀察各組大鼠體質(zhì)量變化。造模后對大鼠毛色、精神狀態(tài)、活動情況、排便情況、進食飲水情況、邊緣耳廓瘀點情況等均進行觀察。

2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)測定

末次給藥30 min后，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，肝素鈉抗凝，室溫靜置20 min后，采用血液流變測試儀檢測1/s、5/s、50/s、100/s、200/s切變率下的全血黏度。使用一次性使用負壓采血管（枸櫞酸鈉1∶4）抗凝，動態(tài)血沉/壓積測試儀測定血沉，血沉測定結(jié)束后，3000 r/min離心30 min，測定紅細胞壓積。

2.4 凝血功能指標(biāo)測定

大鼠麻醉后，腹主動脈取血，一次性使用負壓采血管（枸櫞酸鈉1∶9）抗凝，3500 r/min離心10 min，取上層血漿用于APTT、PT、TT、FIB的測定。

2.5 心電圖測定

將麻醉后的大鼠仰臥固定于大鼠固定板上，采用生物機能實驗系統(tǒng)，記錄心電的5個電極一端與信號采集與處理系統(tǒng)硬件相連接，另一端夾子分別夾在穿過大鼠右前肢（紅）、左前肢（黃）、右后肢（黑）、左后肢（綠）及胸部（白）皮下的針式電極上，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)——II導(dǎo)聯(lián)心電圖，每只大鼠穩(wěn)定后記錄2 min。軟件參數(shù)設(shè)置為：采樣頻率1 kHz，量程2 mV，放大濾波器100 Hz。

2.6 耳廓血流量監(jiān)測

使用激光多普勒系統(tǒng)測定耳廓血流量，血流儀先進行20 min預(yù)熱并用校準(zhǔn)液進行校準(zhǔn)，選用多普勒血流探頭固定于俯臥大鼠右側(cè)距耳廓邊緣5 mm光滑平坦處雙面膠固定，血流儀將采集的信號轉(zhuǎn)換成灌注量單位（perfusion unit，PU），采用配套軟件進行PU值曲線的輸出、記錄，取穩(wěn)定的1 min曲線值的平均值作為其耳廓血流量值。

2.7 腹主動脈、心臟組織病理學(xué)觀察

取各組大鼠腹主動脈、心臟，經(jīng)過4%多聚甲醛固定、脫水透明后石蠟包埋，切片（厚1 mm）后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照，利用CaseViewer軟件進行分析。

2.8 血清中FN、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α、β-TG和PF4含量測定

各組大鼠腹主動脈取血后，室溫自然凝固30 min，3000 r/min離心20 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書測定FN、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α、β-TG和PF4含量。

2.9 心肌組織Akt1、p38和ERK mRNA表達檢測

取各組大鼠心肌組織，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-GAGCCACCAATCCA-CACAGA-3’，下游引物5’-AGACCTCTATGCCAA-CACAGT-3’；上游引物5’-CTGGAGGACAAC-GACTATGGC-3’，下游引物5’-AGCCTCTGTGTAG-GGTCCTTCTT-3’；上游引物5’-ACCTAAAGC-CCAGCAACCT-3’，下游引物5’-GTCATTTCGTC-ATCAGTGTGC-3’；上游引物5’-GGGCA-CCAACCATTGAGCA-3’，下游引物5’-CAAGAG-CTTGTAAAGGTCCGTC-3’。

2.10 心肌組織p-Akt1、Akt1、p-p38、p38、p-ERK和ERK蛋白表達檢測

取各組大鼠心肌組織，剪碎后按加入裂解液裂解30 min，加入小鋼珠勻漿，4 ℃、14 000×離心5 min，取上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量，100 ℃水浴10 min使蛋白變性，于?20 ℃冰箱保存。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉2.5 h，糞便加入β-actin抗體（1∶5000）、Akt1抗體（1∶1000）、p-Akt1抗體（1∶1000）、ERK1/2抗體（1∶500）、p-ERK1/2抗體（1∶1000）、p38抗體（1∶1000）和p-p38抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫搖床孵育1 h，顯影后進行Image J分析。

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 丹紅注射液對急性血瘀大鼠一般狀態(tài)的影響

如表1所示，給藥11 d后，各組間大鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后大鼠出現(xiàn)精神不振、蜷縮不動或活動減少，反應(yīng)遲鈍，弓背、聳毛、皮毛無光澤，喜扎堆、畏寒喜暖、四肢發(fā)冷、寒戰(zhàn)，爪尾部、舌部紫暗，耳廓出現(xiàn)瘀點紫暗（圖1），飲水、進食量減少，大便濕爛、肛門污穢等證候表現(xiàn)，上述證候符合中醫(yī)血瘀的辨證診斷。

表1 丹紅注射液對急性血瘀大鼠體質(zhì)量的影響(, n = 10)

3.2 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響

如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠全血黏度在1/s、5/s、50/s、100/s、200/s切變率均顯著上升（＜0.05、0.01）；與模型組比較，丹紅注射液高劑量組大鼠在1/s、5/s、50/s、100/s、200/s切變率下的全血黏度均顯著降低（＜0.01），丹紅注射液中劑量組大鼠在200/s切變率下的全血黏度顯著降低（＜0.01），舒血寧注射液組大鼠在1/s、50/s、100/s、200/s切變率下的全血黏度均顯著降低（＜0.05、0.01）。

如表3所示，與空白組比較，模型組壓積、紅細胞聚集指數(shù)、卡松黏度均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，丹紅注射液高劑量組壓積、紅細胞聚集指數(shù)、卡松黏度均顯著降低（＜0.05、0.01），舒血寧注射液組卡松黏度顯著降低（＜0.05）。

箭頭表示造模后耳廓形成的瘀點位置

表2 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響(, n = 5)

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01blank group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

表3 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血沉、壓積及血液流變轉(zhuǎn)化的影響(, n = 5)

3.3 丹紅注射液對急性血瘀大鼠凝血功能的影響

如表4所示，與空白組比較，模型組APTT、PT顯著縮短（＜0.01），F(xiàn)IB顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組TT均顯著延長（＜0.05、0.01）。

3.4 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心電圖ST段的影響

如圖2所示，模型組大鼠Q波異常，損傷型ST段明顯抬高，心率無改變，提示出現(xiàn)心肌缺血。如表5所示，與空白組比較，模型組ST段顯著抬高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組ST段均顯著降低（＜0.05、0.01）。

表4 丹紅注射液對急性血瘀大鼠凝血四項指標(biāo)的影響(, n = 5)

圖2 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心電圖的影響

表5 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心電圖ST段的影響(, n = 5)

3.5 丹紅注射液對急性血瘀大鼠耳廓血流量的影響

如表6所示，與空白組比較，模型組大鼠PU顯著降低（＜0.01），說明急性血瘀證模型大鼠可以導(dǎo)致耳廓局部微循環(huán)障礙；與模型組比較，各給藥組PU均顯著升高（＜0.05、0.01），表明DHI可改善急性血瘀證微循環(huán)障礙。

3.6 丹紅注射液對急性血瘀大鼠腹主動脈病理變化的影響

如圖3所示，空白組大鼠動脈內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)完整，層次分明，彈性纖維層結(jié)構(gòu)基本清晰，走向基本一致，排列較整齊；模型組大鼠主動脈各層結(jié)構(gòu)松散無序，內(nèi)膜出現(xiàn)輕微損傷，彈力纖維破壞，由于斑塊脫落導(dǎo)致開始出現(xiàn)空泡；各給藥組大鼠內(nèi)皮結(jié)構(gòu)基本完整，丹紅注射液高劑量組大鼠主動脈結(jié)構(gòu)松散無序，丹紅注射液中劑量組大鼠主動脈結(jié)構(gòu)彈力纖維被破壞，但結(jié)構(gòu)基本清晰，與模型組相比損傷程度較低。

表6 丹紅注射液對急性血瘀大鼠耳廓血流量的影響(, n = 5)

3.7 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心尖組織病理變化的影響

如圖4所示，空白組心肌纖維結(jié)構(gòu)排列整齊緊密，心肌及內(nèi)膜細胞連續(xù)完整，心肌細胞染色均勻，細胞核致密，無水腫，未見炎細胞浸潤；模型組可見心肌細胞排列稍亂，心肌纖維間隔增寬、腫脹、斷裂，出現(xiàn)空泡變性，可見部分肌纖維壞死，心肌細胞加寬，細胞核增大變圓。各給藥組也出現(xiàn)心肌纖維增寬，但較模型組均有不同程度的改善，空泡變性也有所改善，均趨于空白組。與模型組比較，各給藥組表現(xiàn)出較好的心肌保護作用，心肌排列較整齊，空泡現(xiàn)象輕于模型組，舒血寧注射液組和丹紅注射液高劑量組細胞核形狀趨于空白組。

圖3 丹紅注射液對急性血瘀大鼠腹主動脈病理變化的影響 (HE, ×400)

圖4 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心尖組織病理變化的影響(HE, ×400)

3.8 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血清中FN、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α、β-TG和PF4含量的影響

3.8.1 血小板活化黏附相關(guān)指標(biāo) 如表7所示，與空白組比較，模型組FN、vWF含量顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組FN、vWF含量顯著下降（＜0.01）。

3.8.2 血小板聚集性相關(guān)指標(biāo) 如表8所示，與空白組比較，模型組TXB2含量和TXB2/6-keto-PGF1α值顯著上升（＜0.01），6-keto-PGF1α含量顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，舒血寧注射液組和丹紅注射液中劑量組TXB2含量顯著下降（＜0.05、0.01），各給藥組TXB2/6-keto-PGF1α值顯著降低（＜0.01），6-keto-PGF1α含量顯著升高（＜0.05、0.01）。

表7 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血清中FN和vWF含量的影響(, n = 6)

表8 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血清中TXB2、6-keto-PGF1α含量及TXB2/6-keto-PGF1α的影響(, n = 6)

3.8.3 血小板釋放相關(guān)指標(biāo) 如表9所示，與空白組比較，模型組β-TG、PF4含量顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組PF4含量顯著降低（＜0.05、0.01），舒血寧注射液組和丹紅注射液高、中劑量組β-TG含量顯著下降（＜0.05、0.01）。

3.9 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心肌組織Akt1、p38和ERK mRNA表達的影響

如表10所示，與空白組比較，模型組心肌組織內(nèi)、、的mRNA表達水平均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組、、的mRNA表達水平均顯著下降（＜0.01）。

表9 丹紅注射液對急性血瘀大鼠血清中β-TG和PF4含量的影響(, n = 6)

表10 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心肌組織Akt1、p38和ERKmRNA表達的影響(, n = 3)

3.10 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38和p-ERK/ERK蛋白表達的影響

如圖5和表11所示，與空白組比較，模型組心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38、p-ERK/ERK蛋白表達水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38、p-ERK/ERK蛋白表達水平均顯著下降（＜0.05、0.01）。

圖5 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38和p-ERK/ERK蛋白表達的影響

表11 丹紅注射液對急性血瘀大鼠心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38和p-ERK/ERK蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

本研究采用注射腎上腺素模擬人體暴怒時所引起的心率加快、體溫升高的狀態(tài)，再結(jié)合冰水浴，在刺激神經(jīng)和寒邪二者共同作用下復(fù)制寒凝血瘀的模型，可很好地印證中醫(yī)對于血瘀證“寒則凝，凝則成瘀”的認識[15-17]。寒凝血瘀是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，全血黏度增加、血液流動性減弱、凝血時間縮短、微循環(huán)障礙、血管損傷與血小板活化、釋放和聚集等均與寒凝血瘀證相關(guān)[18]。微循環(huán)是心血管系統(tǒng)在組織內(nèi)真正發(fā)揮功能的部位，微循環(huán)障礙會造成血液理化性質(zhì)的改變，使管腔狹窄，血流減慢或血栓形成，使局部組織缺血缺氧甚至壞死，引起一系列的臨床癥狀。微循環(huán)與血瘀證息息相關(guān)，臨床上常運用活血化瘀的藥物改善微循環(huán)以達到活血通絡(luò)化瘀的功效[19]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的行為狀態(tài)、瘀證表現(xiàn)、TT、耳廓微循環(huán)血流量顯著減少，血液全血黏度顯著上升，以上評價指標(biāo)符合在1982年經(jīng)中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會活血化瘀委員會批準(zhǔn)的血液流變學(xué)可作為判斷血瘀證和血瘀證治療效果的依據(jù)[20]，證明血瘀證大鼠模型造模成功。與模型組比較，丹紅注射液組大鼠耳廓瘀點減輕，TT、全血黏度與耳廓微循環(huán)均有明顯改善，可見丹紅注射液有活血化瘀、通脈活絡(luò)、改善微循環(huán)、降低血黏度的效果，能從整體上改善血瘀癥狀，該作用與陽性對照藥物舒血寧注射液有所不同，舒血寧注射液雖能夠改善微循環(huán)和血液流變學(xué)指標(biāo)[21]，對心肌和血管內(nèi)皮具有一定程度的保護作用，對血小板功能具有不同程度的改善，但卻無明顯抗凝作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，寒凝血瘀會導(dǎo)致血管收縮、血管內(nèi)皮損傷，其特征之一是TXA2與前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）的失衡，TXA2與PGI2的平衡狀態(tài)可維持冠脈張力和血小板內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。正常條件下，血小板功能被PGI2等抗凝物質(zhì)抑制，而在炎癥條件下，vWF與其表面受體糖蛋白Ib-IX-V（platelet glycoprotein Ib-IX-V complex，GPIb-IX-V）復(fù)合物被激活，二者結(jié)合活化整合素αIIb/β3，使其與vWF或纖維蛋白原結(jié)合，促進血小板聚集、活化以及血栓的形成[22]，vWF能夠使血小板黏附于血管內(nèi)皮細胞，發(fā)揮止血功能，還可作為判斷血管內(nèi)皮的損傷程度及血栓風(fēng)險的重要指標(biāo)[23-24]，vWF與GPIb-IX-V的結(jié)合可以誘導(dǎo)其下游的重要信號通路磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt和依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）分子的激活[25]，即Akt和P38以及ERK的活化[26]，同時PI3K/Akt和MAPK信號通路可以顯著增強凝血因子釋放和TXA2產(chǎn)生[27]，若TXA2等促凝物質(zhì)生成增加，PGI2等抗凝物質(zhì)生成減少，進一步促進血管收縮、血小板活化、聚集、血栓形成等病理表現(xiàn)[28]。該病理過程刺激血小板產(chǎn)生大量的PF4、β-TG，出現(xiàn)凝血、炎癥等生理反應(yīng)[29]，形成惡性循環(huán)。TXA2由血小板微粒體合成釋放，不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物為穩(wěn)定的TXB2；PGI2具有較強的抑制血小板功能的作用，半衰期很短，一般檢測指標(biāo)為其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α[30]。PF4是血小板活化的特異性指標(biāo)，血小板活化后被大量釋放，黏附于受損的血管內(nèi)皮表面[31]，促進炎性巨噬細胞分化，抑制血管再生[32]；β-TG是血小板α顆粒內(nèi)的糖蛋白，機體缺血后β-TG被釋放至血小板外[33]，二者能夠反映血小板活性。FN可以促進細胞的黏連生長，加強血小板的黏附過程，在損傷的局部形成血小板血栓，具有保護血管內(nèi)皮細胞的功能[34]。本研究中，模型組大鼠心肌細胞纖維斷裂、出現(xiàn)空泡和凋亡現(xiàn)象，并且腹主動脈血管內(nèi)皮出現(xiàn)損傷，心電圖顯示模型組ST段顯著抬高，提示心肌缺血嚴(yán)重；同時，TXB2/6-keto-PGF1α值升高，PF4、β-TG、FN、vWF水平升高，vWF/GPIb-IX-V信號通路激活，其下游分子Akt1、p38、ERK水平上調(diào)，表明模型組大鼠體內(nèi)有血小板聚集、活化等病理過程。給藥后，丹紅注射液組大鼠心肌細胞纖維排列較整齊、空泡凋亡現(xiàn)象減少，對腹主動脈血管內(nèi)皮也有不同程度的改善，心電圖恢復(fù)正常，同時，TXB2降低，6-keto-PGF1α升高，表明丹紅注射液可以保護心肌和血管內(nèi)皮細胞，減少心臟損傷、血管內(nèi)皮損傷及炎癥狀態(tài)，化瘀血生新絡(luò)，調(diào)節(jié)TXB2/6-keto-PGF1α的平衡關(guān)系，降低PF4、β-TG、FN、vWF水平，顯著下調(diào)Akt1、p38和ERK的水平，抑制GPIb-IX-V信號通路介導(dǎo)的血小板活化、聚集和釋放，發(fā)揮抗凝和抗血小板功能的作用，增加微循環(huán)血流量，維持血流正常狀態(tài)，起到治療血瘀證的效果。

本研究成功復(fù)制急性血瘀證大鼠模型，丹紅注射液能夠從整體上改善寒凝血瘀證模型大鼠中醫(yī)證候，保護細胞內(nèi)膜和纖維完整，并通過調(diào)控vWF/GPIb-IX-V下游信號通路相關(guān)蛋白及基因表達，降低vWF、FN、TXB2/6-keto-PGF1α、PF4和β-TG水平，從而保護心肌、改善凝血和血小板功能，達到治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、心肌缺血等臨床疾病[12]的作用，為其在中醫(yī)防治血瘀證及治療心血管疾病方面提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Danhong Injection on promoting blood circulation and removing blood stasis in rats with acute blood stasis based on vWF/GPIb-IX-V signal pathway

LIU Xu1, WU Su-hui1, CHEN Xiao-fei2, ZHANG Yu-hang1, LI Han-bing1, TANG Jin-fa2

1. Henan Provincial Key Laboratory of “Prevention of Disease” Health of Traditional Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Province Engineering Research Center for Clinical Application, Evaluation and Transformation of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

To observe the effect of Danhong Injection (丹紅注射液) on acute blood stasis rats model, and explore the mechanism of Danhong Injection on regulating platelet function of blood stasis syndrome.A total of 60 SD rats were randomly divided into blank group, model group, Shuxuening Injection (舒血寧注射液, 1.8 mL/kg) group and Danhong Injection high-, medium- and low-dose (1.4, 0.7, 0.35 mL/kg) groups. After 11 d of drug intervention, rat model of acute blood stasis syndrome was prepared with sc adrenaline combined with ice water bath. After 1 d of drug intervention, hemorheology index, coagulation function index, platelet activation, adhesion, aggregation and release related indexes were measured; The auricle microcirculation, ECG and histopathological changes of cardiac apex and abdominal aorta were observed; The expressions of protein kinase B1 (Akt1), p38 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in myocardium was detected by qRT-PCR and Western blotting.Compared with blank group, hemorheology, von Willebrand factor (vWF), fibronectin (FN), thromboxane B2(TXB2), β- thrombocyclin (β-TG), platelet factor 4 (PF4) were significantly increased in model group (< 0.05, 0.01), 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-PGF1α) and auricle microcirculation blood flow were significantly decreased (< 0.01), p-AKT1, p-ERK1/2 and p-p38 protein expressions and,, andgene expressions in myocardial tissue were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, Danhong Injection decreased the hemorheological indexes, vWF, FN, TXB2, β-TG, PF4 in different degrees (< 0.05, 0.01), increased 6-keto-PGF1α and thrombin time (TT) (< 0.05, 0.01), protected heart, increased auricle microcirculation blood flow (< 0.05). HE staining results of cardiac apex and abdominal aorta showed that myocardial and vascular intima of rats in model group were slightly damaged, elastic fibers were damaged, and vacuoles began to appear due to the plaque shedding; The myocardial, vascular intima, endothelial cells and elastic fibers of rats in Danhong Injection group were significantly improved.Danhong Injection can restore hemorheology and coagulation function, improve the function of vascular endothelial cells and cardiac myocytes, and has better protective and therapeutic effects on acute blood stasis in rats by regulating platelet function mediated by vWF/GPIb-IX-V signal pathway.

Danhong Injection; acute blood stasis; cardiovascular disease; platelet function; von Willebrand factor; platelet glycoprotein Ib-IX-V complex

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1173 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.017

2022-09-29

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項（20-21ZY1001）；河南省高校科技創(chuàng)新團隊（23IRTSTHN026）

劉 旭，女，碩士研究生，研究方向為中藥藥理實驗技術(shù)。E-mail: 2695350081@qq.com

李寒冰，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥學(xué)研究。E-mail: lhb8899@163.com

唐進法，男，主任藥師，研究方向為中藥質(zhì)量評價及合理應(yīng)用。E-mail: a0519@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]