荊防顆粒對急性醉酒模型小鼠的解酒作用及作用機制

高 銘，張 霞，羅戴民，楊若聰，饒志粒，曾 南*

荊防顆粒對急性醉酒模型小鼠的解酒作用及作用機制

高 銘1, 2，張 霞1, 2，羅戴民1, 2，楊若聰1, 2，饒志粒1, 2，曾 南1, 2*

1. 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137

建立小鼠醉酒模型，探究荊防顆粒的解酒作用及其作用機制。將雌雄各半SPF級昆明種小鼠隨機分為模型組和荊防顆粒組，模型組ig生理鹽水，荊防顆粒組ig荊防顆粒30 min后，小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg）構建急性醉酒模型，以翻正反射消失/恢復時間評價各組小鼠醉酒潛伏期和睡眠時間，并計算醉酒率；轉棒實驗觀察小鼠ig白酒10 min后的在棒時間，并觀察小鼠胃黏膜損傷情況。進一步基于急性醉酒小鼠模型，觀察藥物對小鼠肝組織酒精代謝酶乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、過氧化氫酶（catalyse，CAT）、細胞色素P450第二家族E亞型多肽1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的調節(jié)作用；Western blotting考察荊防顆粒對細胞自噬通路相關蛋白表達的影響。與模型組比較，荊防顆粒降低小鼠醉酒率，并明顯延長小鼠在棒時間及減輕胃黏膜損傷，表現出解酒作用；荊防顆粒顯著提高模型小鼠肝組織ADH、CAT活力（＜0.05、0.01、0.001），逆轉過量飲酒導致的CYP2E1蛋白表達升高（＜0.001），升高模型小鼠肝組織ADH1、ALDH2蛋白表達（＜0.05、0.01）；明顯上調模型小鼠肝組織微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ）/LC3I值（＜0.01），降低p62蛋白表達（＜0.05）。荊防顆粒能降低小鼠醉酒率，改善過度飲酒引起的中樞抑制及胃黏膜損傷表現，呈現出解酒作用；其作用機制可能與提高酒精代謝酶ADH、CAT、ALDH活力或表達以加速機體酒精代謝，激活自噬，緩解CYP2E1誘導的損傷有關。

解酒；荊防顆粒；酒精代謝；自噬；急性醉酒模型小鼠

自古以來，酒精與人類的文化生活密切相關。然而過量飲酒會引起急性、慢性酒精中毒，給身體帶來許多危害，如增加心臟負擔、破壞肝細胞結構，引起消化、心血管及神經系統(tǒng)在內的多組織器官損傷，導致人體出現頭昏、惡心、嘔吐、動作遲緩、記憶力減退、昏迷等癥狀，嚴重時可致死亡[1-2]。為緩解單次過量飲酒給機體造成的損害，提高大眾健康質量，解酒護肝產品的研發(fā)成為研究熱點。荊防顆粒源自荊防敗毒散，該方最早記載于明代張時徹《攝生眾妙方》，由荊芥、防風、羌活、獨活、柴胡、川芎、桔梗、前胡、枳殼、茯苓、甘草11味中藥組成，具有發(fā)汗解表、散風祛濕之功效[3-4]。研究報道，荊防顆粒連續(xù)ig給藥8周對四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化有明顯保護作用，可降低模型小鼠血清天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性及總膽汁酸（total bile acid，TBA）和三酰甘油（triglyceride，TG）水平，并減輕肝細胞變性、壞死及炎性細胞浸潤；同時發(fā)現荊防顆粒能降低肝組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平[5]，表明荊防顆粒對機體主要解毒器官——肝臟有一定保護作用。荊防敗毒散加減方單次預防給藥能明顯降低急性酒精中毒小鼠醉酒率并延長醉酒潛伏期；單次治療給藥可降低急性酒精中毒小鼠血液乙醇濃度，提高小鼠肝臟和胃組織乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、SOD活性，降低MDA含量，促進酒精代謝，表現出良好解酒促醒作用[6]。上述實驗結果表明荊防敗毒散對四氯化碳和酒精引起的肝臟損傷有保護作用，本課題組既往研究亦發(fā)現荊防顆粒能降低醉酒小鼠血液中乙醇含量，其解酒作用可能與激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路有關[7]。一般而言，攝入機體的酒精90%以上會經胃腸道吸收，僅少量通過呼吸、汗液、尿液等排出體外。由胃腸道吸收的部分酒精在胃腸道的首過代謝下被氧化，更多的酒精則是通過門靜脈進入肝臟，經肝臟內豐富的酶進行代謝[8]。此外，進入血液循環(huán)后的少量酒精還可透過血腦屏障，由大腦中的酶系統(tǒng)代謝。總之，進入肝臟的酒精通過氧化途徑和非氧化途徑進行代謝，前者主要涉及ADH和微粒體乙醇氧化系統(tǒng)（microsomal ethanol oxidizing system，MEOS）如細胞色素P450第二家族E亞型多肽1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）和過氧化氫酶（catalyse，CAT），后者參與酒精代謝的比例較低，一般是在酶介導下酒精與內源性代謝物如葡萄糖醛酸、硫酸鹽、磷脂和脂肪酸的結合，生成相應代謝物[9]。本研究基于前期研究基礎及部分人群服用體驗結果，構建小鼠急性醉酒模型，擬進一步明確荊防顆粒的解酒效應表現及可能相關的作用機制，旨在為荊防顆粒臨床應用的拓展提供一定科學依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，購自北京斯貝福實驗動物有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學藥學院動物觀察室，許可證號SYXK（川）2020-124。所有動物均自由進食進水，在明暗各12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)，光照時間為8: 00～20: 00時，環(huán)境溫度保持在（22±2）℃。本實驗符合動物實驗倫理學要求，獲成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的批準（批準號20200320）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號0012008009）購自山東新時代藥業(yè)有限公司；-乙酰--半胱氨酸（-acetyl--cysteine，NAC，批號824O033）購自北京索萊寶科技有限公司；56°紅星二鍋頭（批號20191204）購自北京紅星股份有限公司；CAT檢測試劑盒（批號071321220513）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）/還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）檢測試劑盒（批號052021220128）購自碧云天生物技術有限公司；小鼠ADH試劑盒（批號8AKF434LSX）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；ADH1兔抗（批號5295S）、p62兔抗（批號23214S）購自美國CST公司；CYP2E1兔抗（批號54i7601）購自Affinity Antibody公司；乙醛脫氫酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）兔抗（批號323861）、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3）兔抗（批號334372）購自上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司；β-actin兔抗（批號AC220227008）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗（批號AC2111013A）、β-tubulin兔抗（批號AC2101019B）購自武漢賽維爾公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號BST17G08A17H54）購自博士德生物公司。

1.3 儀器

MDF-U50V型超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；UPT-2-5T型超純水儀（成都優(yōu)普電子產品有限公司）；ZB-200型疲勞轉棒儀（成都泰盟軟件有限公司）；KZ-II型高效組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；ST16R型低溫高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）；ChemiDocXRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)、ImageLab凝膠分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 荊防顆粒預防給藥對小鼠的解酒作用

將SPF級昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質量分層隨機分為模型組和荊防顆粒高、中、低劑量（15、10.5、5.25 g/kg）組，每組20只，雌雄各半。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，實驗當日各給藥組ig相應藥物（20 mL/kg），模型組ig等體積生理鹽水，給藥30 min后，各組小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg），隨即觀察小鼠行為狀態(tài)，小鼠醉酒以翻正反射消失為標準：小鼠背向下的姿勢保持30 s以上，則認為翻正反射消失，即為醉酒，計算各組小鼠醉酒率。記錄各組小鼠醉酒潛伏期時間（從ig白酒到翻正反射消失的時間）和睡眠時間。以小鼠ig白酒的時間開始計時觀察8 h，若8 h后醉酒狀態(tài)仍然未恢復的小鼠，按照480 min進行計算。根據本次實驗中荊防顆粒3個劑量組對急性醉酒模型小鼠醉酒率的影響結果，選擇具有明顯效應的2個劑量開展后續(xù)醉酒小鼠在棒時間及胃黏膜損傷實驗研究，并重復觀察小鼠醉酒率。

醉酒率＝醉酒小鼠只數/該組小鼠總只數

2.2 荊防顆粒預防給藥對醉酒小鼠在棒時間及胃黏膜損傷的影響

SPF級昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質量分層隨機分為4組，雌雄各半，其中對照組8只，4個處理時間批次（給酒后30、60、90、120 min）的模型組50只、荊防顆粒15 g/kg組40只及荊防顆粒10.5 g/kg組40只。各組小鼠禁食不禁水12 h后，實驗當日各給藥組ig相應藥物（20 mL/kg），模型組ig等體積生理鹽水，給藥30 min后，除對照組外，其余各組小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg），對照組ig等體積的生理鹽水。ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg）10 min后將未進入醉酒狀態(tài)的小鼠放在轉棒儀上，觀察記錄小鼠在棒時間，觀察時間為2 min，超過2 min未掉下者按2 min計，同法觀察對照組小鼠ig生理鹽水10 min后的在棒時間。4個處理時間批次的小鼠分別于給酒后30、60、90、120 min處死并剖取胃，結扎胃部賁門和幽門，以2 mL 10%福爾馬林固定5 min后，沿胃大彎剖開，觀察酒精對胃黏膜的影響。對照組小鼠同法取樣觀察。采用半定量分析方法，損傷程度按照整個胃黏膜中肉眼觀察到的胃出血點數目作為分級計分標準，見表1。

表1 胃黏膜肉眼觀察評分標準

2.3 荊防顆粒預防給藥對醉酒小鼠酒精代謝酶活性及自噬相關蛋白表達的影響

SPF級昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，按體質量分層隨機分為5組，雌雄各半，分別為對照組8只，模型組12只，荊防顆粒高、低劑量（15、10.5 g/kg）組各12只和NAC（300 mg/kg）組12只。小鼠禁食不禁水12 h后，實驗當日各給藥組ig相應藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig等體積生理鹽水，給藥1 h（依據預試驗結果）后，除對照組外，其余各組小鼠ig 56°紅星二鍋頭（17 mL/kg），對照組ig等體積的生理鹽水。ig白酒1 h（酒后30～60 min血液乙醇濃度可達高峰[10]）后小鼠眼眶取血并頸椎脫臼處死，剖取肝臟、胃組織將其凍存?zhèn)溆谩Ｈ「闻K、胃組織，按試劑盒說明書加入提取液，進行組織研磨，制成10%組織勻漿，檢測肝組織中ADH、CAT活力以及肝、胃組織中NAD+/NADH值。

加入RIPA裂解液提取肝組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調等濃度后，加上樣緩沖液使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白溶液封閉90 min，分別加入一抗ADH1（1∶1000）、CYP2E1（1∶1000）、ALDH2（1∶2000）、LC3（1∶1000）、p62（1∶1000）、β-actin（1∶2000）、GAPDH（1∶2000）、β-tubulin（1∶2000），4 ℃孵育過夜，洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶5000）孵育90 min，再次洗膜后在顯影成像儀中顯色曝光，采用Image Lab 6.0.1軟件分析條帶。

2.4 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 荊防顆粒預防給藥對小鼠的解酒作用

以小鼠ig白酒至翻正反射消失的時間為醉酒潛伏期，翻正反射消失至翻正反射恢復的時間為小鼠睡眠時間。如表2所示，模型組小鼠的醉酒率為90%，而荊防顆粒（15、10.5、5.25 g/kg）組小鼠的醉酒率分別為0、25%、75%，表明荊防顆粒預防給藥具有一定解酒作用，尤以15、10.5 g/kg劑量組效果明顯。后續(xù)在棒時間實驗中重復觀察了15、10.5 g/kg劑量組小鼠的醉酒率，結果表明模型組小鼠醉酒率為90%，而荊防顆粒15、10.5 g/kg劑量組小鼠醉酒率分別為7.31%、10%；進一步在解酒機制研究實驗中，再次觀察荊防顆粒對小鼠醉酒率的影響，結果表明模型組、荊防顆粒15、10.5 g/kg以及NAC組的醉酒率分別為75%、8%、17%和67%。綜上，荊防顆粒15、10.5 g/kg預防給藥具有明確解酒作用，能顯著降低醉酒率。

表2 荊防顆粒對小鼠醉酒率及醉酒時間的影響(, n = 20)

與模型組比較：###＜0.001

###< 0.001model group

3.2 荊防顆粒預防給藥對小鼠在棒時間的影響

轉棒實驗主要檢測嚙齒類動物運動功能，當其中樞神經系統(tǒng)損害或藥物對其運動協調功能產生影響時，可通過測量動物在滾筒上行走的持續(xù)時間評定。小鼠過量飲酒后，中樞神經系統(tǒng)被抑制，協調性會變差，致使小鼠很快從轉棒上掉落，在棒時間縮短。如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠ig白酒10 min后，在轉棒儀上的時間明顯縮短（＜0.001），提示動物出現步態(tài)、平衡功能障礙；與模型組比較，荊防顆粒能延長模型小鼠的在棒時間。

3.3 荊防顆粒對醉酒小鼠胃黏膜的影響

急性大量飲酒會直接損傷胃黏膜，甚至造成胃出血，因此在解酒實驗中同時觀察荊防顆粒對胃黏膜的保護作用。如圖1和表4所示，與模型組比較，小鼠ig白酒后30、60、90、120 min，荊防顆粒15、10.5 g/kg劑量組小鼠胃黏膜損傷程度有明顯減輕表現（＜0.05、0.01、0.001），小鼠胃黏膜出血表現有所緩解，出血點數顯著降低。

表3 荊防顆粒對小鼠ig白酒10 min后在棒時間的影響()

與對照組比較：***＜0.001

***< 0.001control group

圖1 荊防顆粒對醉酒小鼠胃黏膜損傷的影響

表4 荊防顆粒對醉酒小鼠胃黏膜損傷的影響()

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001model group, same as below tables

3.4 荊防顆粒對醉酒小鼠肝、胃組織NAD+/NADH值的影響

NAD是存在于所有細胞中的一種輔酶，包括NAD+（氧化型）和NADH（還原型）2種形式。乙醇代謝過程中，其首先在ADH的作用下氧化成乙醛，此過程中NAD+被還原成NADH。因此通過比較各組NAD+/NADH值，可間接判斷ADH活力。如表5所示，與模型組比較，荊防顆粒（15、10.5 g/kg）組胃組織NAD+/NADH值均顯著降低（＜0.05），荊防顆粒（15 g/kg）組小鼠肝組織NAD+/ NADH值顯著降低（＜0.05），說明荊防顆粒促進了NAD+向NADH的轉化，增加了NADH，表明藥物可提高ADH對乙醇的代謝能力。

3.5 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH、CAT活性的影響

ADH是機體代謝酒精最主要的酶，荊防顆粒可促進NAD+被還原成NADH，提示藥物對該酶活性有提高作用；CAT分布非常廣泛，在肝臟、腎臟和紅細胞中水平高，是清除能導致氧化損傷的過氧化氫的主要場所，乙醇代謝過程中，CAT也參與部分乙醇代謝，同時生成水和氧氣。因此對醉酒小鼠肝組織ADH、CAT活力進行檢測。如表6所示，與模型組比較，各給藥組均可提高小鼠肝組織ADH活力，其中荊防顆粒15 g/kg組具有顯著性差異（＜0.05），表明荊防顆粒解酒作用的發(fā)揮確與提高ADH活力有關；同時各給藥組均能顯著提高CAT活力（＜0.01、0.001），提示荊防顆粒還可通過提高機體抗氧化能力發(fā)揮解酒作用。

表5 荊防顆粒對醉酒小鼠胃、肝組織NAD+/NADH值的影響()

表6 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH和CAT活性的影響()

3.6 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2、CYP2E1蛋白表達的影響

ALDH是酒精氧化途徑的第2步，也是代謝引起酒精中毒關鍵分子——乙醛的唯一酶。當血液及組織液中的酒精濃度＞10 mmol/L時，微粒體乙醇氧化系統(tǒng)也參與酒精代謝[11]，其中CYP2E1是該系統(tǒng)中研究最多的酒精代謝酶。因此在明確荊防顆粒對ADH、CAT活性的調節(jié)作用后，進一步觀察荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織中ADH1、ALDH2、CYP2E1蛋白表達的影響，如圖2和表7所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織中ADH1蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），說明單次過量飲酒可能抑制肝臟正常酒精代謝；與模型組比較，15 g/kg荊防顆粒顯著升高醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2蛋白表達（＜0.05、0.01），表明荊防顆粒能通過上調ADH、ALDH的表達以促進酒精代謝。此外，模型組小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達顯著升高（＜0.01），提示過量飲酒會誘導CYP2E1參與肝臟酒精代謝，而該代謝過程伴隨活性氧（reactive oxidative species，ROS）的產生；荊防顆粒和NAC能顯著逆轉該表現（＜0.01、0.001），說明荊防顆粒對過量飲酒導致的氧化應激可能具有一定緩解作用。

3.7 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織自噬通路LC3及p62蛋白表達的影響

如圖3和表8所示，與對照組比較，模型組小鼠肝組織內LC3Ⅱ/LC3I升高，提示急性醉酒模型小鼠肝細胞的自噬可能被激活，啟動一定代償保護效應；與模型組比較，荊防顆粒組LC3Ⅱ/LC3I顯著升高（＜0.01），表明荊防顆粒解酒作用的發(fā)揮可能與激活自噬清除異物有關。與對照組比較，醉酒小鼠肝組織中p62蛋白表達上調（＜0.05），提示模型小鼠肝組織的自噬-溶酶體降解存在障礙；與模型組比較，荊防顆粒能顯著促進自噬小體的降解，明顯下調p62蛋白表達（＜0.05）。提示在急性醉酒狀態(tài)下，荊防顆粒可激活自噬并促進自噬小體降解加速酒精代謝，從而發(fā)揮肝臟保護作用。

圖2 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2和CYP2E1蛋白表達的影響

表7 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織ADH1、ALDH2和CYP2E1蛋白表達的影響()

圖3 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織自噬通路相關蛋白表達的影響

表8 荊防顆粒對醉酒小鼠肝組織自噬通路相關蛋白表達的影響()

4 討論

無論發(fā)達還是非發(fā)達國家，飲酒是常見的大眾行為之一[12]，尤其是當下生活壓力日益增長，飲酒更成為大多數人排解壓力的方法之一。但飲酒過量，同樣會對身體健康造成危害。近年來，急性酒精中毒在臨床上也越來越常見。急性酒精中毒，俗稱醉酒[13]，中醫(yī)病名“酒毒”。醉酒是指飲酒過量所引起的急性臟腑功能受損，并出現惡心嘔吐、脅腹脹滿、易怒易激、行走不穩(wěn)或譫妄昏迷等癥狀，屬中醫(yī)常見急癥，嚴重者可發(fā)生呼吸循環(huán)衰竭，最終導致死亡[14]。目前臨床上治療急性酒精中毒的藥物主要有利尿藥、蛋白肽類藥、提高酒精代謝酶活性類藥及護肝養(yǎng)胃類中藥4種[15]，然而并無明確適合大眾日常生活中有效便捷的解酒藥物。已有研究發(fā)現荊防敗毒散加減及荊防敗毒散現代制劑荊防顆粒有良好的解酒防醉作用[6-7]，本研究在前期研究基礎上開展其解酒作用與機制研究，進一步豐富其解酒作用研究內容，為其臨床應用拓展與二次開發(fā)提供一定藥理學依據。

小鼠過量飲酒初期呈現呼吸、心率加快等興奮表現，繼而出現體態(tài)不穩(wěn)、共濟失調，最后進入昏睡狀態(tài)[16]。實驗中常以翻正反射消失作為判斷小鼠是否出現急性酒精中毒（醉酒）表現的標準，即小鼠保持背向下姿勢＞30 s不恢復可稱為醉酒。此外大量飲酒亦會造成動物胃黏膜急性損傷[17]。因目前尚未見性激素對酒精代謝影響的報道，且飲酒行為男女均有，故研究中選用雌雄各半的小鼠開展荊防顆粒的解酒實驗研究，結果表明荊防顆粒能顯著降低小鼠的醉酒率，延長小鼠醉酒潛伏期，表現出解酒作用，同時給藥組無小鼠死亡表現，提示藥物具有保護作用；進一步轉棒儀實驗表明荊防顆粒可延長小鼠的在棒時間，且通過肉眼觀察評分發(fā)現荊防顆粒組小鼠胃黏膜出血點明顯少于模型組小鼠，結合前期研究結果荊防顆粒能顯著降低醉酒小鼠血清乙醇含量[7]，可認為荊防顆粒具有解酒防醉作用，并對大量飲酒所致的胃黏膜損傷有一定保護作用。

肝臟是酒精代謝主要器官，通過幾種代謝酶和非酶機制將90%以上攝入的酒精代謝成乙醛，隨后乙醛進一步被線粒體中的ALDH2和細胞質中的ALDH1氧化為醋酸，最后醋酸經三羧酸循環(huán)，徹底氧化為水和二氧化碳排出體外，少部分生成蛋白質、脂肪等大分子物質被機體利用[18]。肝臟中酒精主要經ADH、CAT、CYP2E1 3種酶代謝生成為乙醛。ADH是一種位于胞質中的鋅依賴性酶，其中I類ADH在肝、胃、腎和結腸等組織中表達水平較高，其使用NAD+作為輔助因子，參與肝臟中大部分酒精的氧化。ADH對乙醇的代謝受ADH酶、副產物乙醛水平以及細胞質中NADH與NAD+比率的調節(jié)[11]。CAT雖然在酒精代謝過程中貢獻較小，但能以H2O2依賴的方式將乙醇氧化為乙醛，研究表明乙醇長期喂養(yǎng)后可使大鼠肝臟CAT活性增加[19]。本研究結果顯示，荊防顆粒顯著促進醉酒模型小鼠肝、胃組織中NAD+向NADH的轉化，并提高肝組織ADH的活性以及ADH1蛋白表達量；同時顯著提高模型小鼠肝組織CAT活性。由此可認為，荊防顆粒能通過提高ADH、CAT對酒精的代謝能力，來加快肝臟對酒精的代謝速率，從而發(fā)揮良好的解酒防醉作用。此外，酒精可被微粒體乙醇氧化體系氧化，該系統(tǒng)主要涉及CYP2E1[20]，另外2種細胞色素CYP1A2和CYP3A4對微粒體乙醇氧化體系也有貢獻，但影響程度較弱[21]。CYP2E1主要在血液酒精濃度較高或長期飲酒的酒精代謝中發(fā)揮重要作用，其參與酒精代謝的同時還會促進羥乙基自由基（HER）、羥自由基（OH?）和超氧化物（O2?）等一系列ROS的產生，被認為是酒精誘導肝細胞氧化應激的主要因素之一[22]。本研究結果發(fā)現，模型組小鼠肝組織CYP2E1表達顯著升高，結合模型小鼠肝組織ADH1表達下降表現，提示過量飲酒后CYP2E1被誘導表達增加，主要負責肝臟中酒精代謝，然而作為肝細胞氧化應激的主要貢獻者，以CYP2E1為主導的酒精代謝對肝臟是不利的。荊防顆粒對模型小鼠肝臟CYP2E1表達有明顯下調表現，提示其可抑制CYP2E1代謝途徑，由此緩解過量飲酒引起的氧化應激所致損傷。ALDH2在代謝飲酒產生的乙醛及減輕氧化應激下脂質過氧化副產物4-羥基壬烯酸的毒性中均發(fā)揮著重要作用[23]，本研究結果表明荊防顆粒能顯著提高模型小鼠肝組織ALDH2表達量，提示該顆粒在促進乙醇氧化的同時還可加速機體內乙醛代謝，呈現解酒保肝作用。荊防顆粒對肝臟中包括ADH、CAT、CYP2E1、ALDH在內的酒精代謝酶調節(jié)作用如圖4所示。

圖4 荊防顆粒對肝臟酒精代謝酶影響的機制圖

氧化應激過程中產生的ROS被認為是自噬的激活物，能夠參與誘導自噬的啟動，另一方面自噬可作為緩沖系統(tǒng)來控制ROS的水平[24]。前期研究表明荊防顆粒可激活急性醉酒模型小鼠肝組織PI3K/Akt信號通路發(fā)揮解酒作用[7]，而已有研究證實肝損傷模型中激活的PI3K/Akt信號通路可上調自噬[25]，且本實驗中的急性醉酒模型小鼠肝臟CYP2E1蛋白表達異常升高，而該酶參與酒精代謝的同時會伴隨過量ROS的產生，引起氧化失衡，誘導自噬來緩沖控制ROS的損傷。基于此進一步觀察荊防顆粒對模型小鼠肝組織自噬的影響，結果顯示荊防顆粒可顯著升高LC3Ⅱ/LC3I值表現出激活自噬，并顯著下調p62蛋白表達表現出促進自噬小體降解的作用，從而發(fā)揮保護肝臟作用，研究結果亦與以往結果[7]吻合。

綜上，荊防顆粒能顯著降低醉酒小鼠醉酒率，并保護過量飲酒造成的胃黏膜損傷，其解酒作用的發(fā)揮與提高肝、胃組織ADH對酒精的轉化效率，升高肝組織中ADH、ALDH、CAT的表達或活力，促進乙醛代謝，對抗過量飲酒誘發(fā)的氧化應激，及激活肝組織自噬與促進自噬小體降解有關。研究結果初步明確了荊防顆粒解酒防醉的作用機制，同時提示對急性酒精性肝損傷可能具有保護作用。然而，本研究存在一些不足之處，如未涉及更多酒精誘導肝臟氧化應激的相關指標，后續(xù)可進一步補充荊防顆粒抗氧化的解酒作用機制研究，以豐富荊防敗毒散及其制劑荊防顆粒的現代藥理研究內容。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-drinking effect and mechanism of Jingfang Granules on acute drunkenness model mice

GAO Ming1, 2, ZHANG Xia1, 2, LUO Dai-min1, 2, YANG Ruo-cong1, 2, RAO Zhi-li1, 2, ZENG Nan1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China 2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To investigate the anti-drinking effect and mechanism of Jingfang Granules (荊防顆粒) by establishing a mouse model of drunkenness.Male and female half SPF grade Kunming mice were randomly divided into model group and Jingfang Granules group. After ig saline in model group and ig Jingfang Granules in Jingfang Granules group for 30 min, mice were ig liquor (17 mL/kg) to establish an acute intoxication model. The intoxication latency and sleep time of each group were evaluated by the disappearance/recovery time of righting reflex, and intoxication rate was calculated. The stick-turning experiment was conducted to observe the in-stick time of the mice after taking liquor for 10 min and to observe the damage to the gastric mucosa of the mice. Based on an acute intoxication mouse model, the effect of Jingfang Granules on alcohol metabolism enzymes such as alcohol dehydrogenase (ADH), catalase (CAT), cytochrome P450 second family E subtype polypeptide 1 (CYP2E1) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) in liver tissue of mice were evaluated; Effect of Jingfang Granules on the expression of proteins related to the autophagy pathway were observed by Western blotting.Compared with model group, Jingfang Granules reduced the rate of intoxication and prolonged the time of mice on the stick, and alleviated the gastric mucosal damage, which showed the effect of an alcohol reliever; Jingfang Granules significantly increased ADH and CAT activity in liver tissues of model mice (< 0.05, 0.01, 0.001), reversed the increase in CYP2E1 expression caused by excessive alcohol consumption (< 0.001), and increased the expression of ADH1 and ALDH2 in liver tissue of model mice (< 0.05, 0.01), significantly up-regulated the expression ratio of microtubule-associated protein1 light chain 3Ⅱ (LC3II)/LC3I in liver tissue (< 0.01) and reduced the expression of p62 protein (< 0.05).Jingfang Granules could reduce the rate of intoxication in mice, and improve the manifestation of central inhibition and gastric mucosal damage caused by excessive alcohol consumption, which presents an antidotal effect. Its mechanism may be related to increasing the activity or expression of alcohol-metabolizing enzymes such as ADH, CAT and ALDH, which accelerate alcohol metabolism and activate autophagy to alleviate the CYP2E1-induced damage.

detoxification; Jingfang Granules; alcohol metabolism; autophagy; acute drunkenness model mice

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1164 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.016

2022-09-26

國家自然科學基金資助項目（82074094）；西南特色中藥資源國家重點實驗室開放研究基金項目（2020XSGG002）

高 銘，碩士研究生，研究方向為中藥藥理與毒理。E-mail: 1500972433@qq.com

曾 南，教授，博士生導師，主要從事中藥藥理和毒理學研究。E-mail: zengnan966@126.com

[責任編輯 李亞楠]