慢性腎病大鼠血清Bcl-3、Gal-3、TGF-β1與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系*

黃越熙 毛海霞 張麗玲 李艷 吳蔚樺 歐三桃

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000 2.四川省腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 瀘州 646000)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)是一個全球性的公共問題，其患病率逐年上升[1]。而腎纖維化是各種CKD進展至終末期的主要病理改變和共同通路，其嚴重程度與患者的治療選擇及預(yù)后判斷關(guān)系密切，因此準確評估腎纖維化程度具有十分重要的意義[2]。臨床上腎活檢是診斷腎纖維化的金標準，可以準確直觀地了解腎臟病理改變及判斷腎纖維化程度，但是有創(chuàng)操作，實施有一定的局限性，B 超、CT、MRI 等非侵入性手段可一定程度地可用于腎纖維化的判斷，但是這些檢查只能通過腎臟解剖改變間接反映腎纖維化情況，難以早期發(fā)現(xiàn)并判斷其嚴重程度[3]。而生物標志物既能評估或定量測量某種疾病的生物學(xué)和病理學(xué)進程，同時也可作為疾病的治療靶點[4]。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腎纖維化診斷生物標志物，但尚無公認的判斷腎纖維化的標記物，因此深入探討并篩選出有價值的生物標記物具有十分重要的意義。B細胞淋巴瘤因子3(B cell lymphoma 3,Bcl-3)、大鼠半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3)是近年來有應(yīng)用前景的潛在腎纖維化生物標志物，但其價值還需進一步研究。本研究旨在通過建立腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD大鼠模型并檢測大鼠血清Bcl-3、Gal-3、轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)水平，分析其與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系，探討其是否可成為判斷腎纖維化的新型生物標志物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD大鼠20只，體重(200±10) g，8周齡，購自西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(川)2018-17]。于西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心動物房飼養(yǎng)并取材[SYXK(川)2018-065]。本實驗遵循“3R”原則給予人道的關(guān)懷。經(jīng)由西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批通過(swmu20220018)。

1.2 主要儀器及試劑 腺嘌呤(Sigma公司，美國)；Gal-3 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，中國)、大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，中國)、大鼠Bcl-3 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，中國)；Masson染色液(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，中國)；α-SMA抗體(武漢博士德生物工程有限公司；中國)；高速冷凍離心機(Eppendorf 公司，德國);全自動生化分析儀(西門子，德國)；石蠟切片機(Thermo公司，美國)；光學(xué)顯微鏡(Nikon公司，日本)；酶標儀(Rayto，RT-6100)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組和模型制備 SPF級雄性SD大鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組(n=10)和模型組(CKD，n=10)。腺嘌呤溶于蒸餾水，制成2.5%混懸液，CKD組第1～4周每日定時給予腺嘌呤混懸液250 mg/(kg·d)灌胃，第5～6周給予腺嘌呤混懸液125 mg/(kg·d)灌胃；對照組給予等體積生理鹽水灌胃，兩組均予以普通飼料喂養(yǎng)。所有大鼠自由進食及飲水，光照時間明暗各半，室溫18℃～25℃。

1.3.2 標本采集 分別于第3、6周末處死大鼠，經(jīng)腹主動脈采血；留取腎組織置于10%中性福爾馬林液中固定，制成石蠟切片，另一部分腎組織凍存于-80℃冰箱中用。

1.3.3 血尿素氮、肌酐及Bcl-3、Gal-3、TGF-β1指標檢測 全自動生化分析儀測定大鼠腎功能。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 測定血清Bcl-3、Gal-3、TGF-β1含量。所有試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 腎組織HE染色 固定的腎組織經(jīng)脫水、包埋、切片后，脫蠟至水、染色、封片，觀察腎臟病理改變。

1.3.5 腎組織Masson染色 固定的腎組織經(jīng)脫水、包埋、切片后，脫蠟至水；切片入Bouin液，37℃溫箱內(nèi)2 h，流水沖洗；天青石藍染料滴染2～3 min，稍水洗；Mayer蘇木素染色液滴染2～3 min，稍水洗；酸性乙醇分化液分化數(shù)秒，流水沖洗10 min；麗春紅品紅染色液滴染10 min，蒸餾水稍水洗；磷鉬酸溶液處理10 min；傾去上液，滴入苯胺藍染色液染5 min；弱酸溶液處理2 min；脫水、透明、中性樹膠封固。每例選取3張切片觀察10個非重復(fù)視野(200×)，以藍色為陽性表達，計算Masson染色陽性面積占整個視野的百分比，對其進行半定量分析[5]。半定量評分標準：0分，無著色；1分，輕度，面積<10%；2分，中度，面積11%～25%；3分，重度，面積26%～50%；4分，極重度，面積>50%。

1.3.6 免疫組化檢測大鼠腎組織α-SMA蛋白表達 腎組織石蠟切片脫蠟至水后行抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶 10 min，山羊血清封閉液封閉，滴加一抗、二抗、DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水封片。每例切片觀察10個非重復(fù)視野(200×)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號，應(yīng)用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件分析陽性染色所占面積百分比，取其均值，結(jié)果用百分比表示[5]。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠腎功能比較 與對照組比較，CKD組大鼠各時間點血尿素氮、肌酐水平均明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠腎功能比較Table 1 Comparison of renal function between two groups of rats

2.2 兩組大鼠血清Bcl-3、Gal-3、TGF-β1水平比較 與對照組比較，CKD組大鼠各時間點血Bcl-3、Gal-3和TGF-β1水平均明顯升高(P<0.05) ；在CKD組內(nèi)，Bcl-3在6周的水平較3周明顯升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組大鼠血清Bcl-3、Gal-3、TGF-β1水平比較Figure 1 Comparison of serum Bcl-3,Gal-3 and TGF-β1 levels in two groups of rats注：與對照組同一時間點比較，①P<0.05；與 CKD 組同一時間點比較，②P<0.05

2.3 兩組大鼠腎組織HE染色情況 對照組各時間點腎組織無明顯病理改變，而CKD組各時間點可見腎小管上皮細胞變性壞死、擴張、間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生以及炎細胞浸潤，且第6周比第3周改變更明顯，見圖2。

圖2 兩組大鼠腎組織HE染色Figure 2 HE staining of renal tissue in two groups of rats

2.4 兩組大鼠腎組織Masson染色情況及腎間質(zhì)纖維化評分 對照組大鼠第3周末及第6周末的腎間質(zhì)未見明顯膠原纖維沉積；CKD 組大鼠腎間質(zhì)可見藍色膠原纖維沉積增多，且第6周末較第3周末明顯增多(P<0.05)。CKD組腎間質(zhì)膠原纖維相對面積評分也明顯高于對照組，且第6周末高于第3周末(P<0.05)。見圖3。

圖3 Masson染色結(jié)果及腎間質(zhì)膠原纖維相對面積評分Figure 3 Masson staining results and relative area score of interstitial collagen fibers in the kidney注：與 對照組同一時間點比較，①P<0.05；與 CKD 組比較，②P<0.05

2.5 兩組大鼠α-SMA免疫組化染色情況 對照組大鼠各時間點腎間質(zhì)中未見α-SMA的表達，但在CKD組大鼠腎間質(zhì)中α-SMA表達明顯增加(P<0.05)，見圖4。

圖4 兩組大鼠α-SMA免疫組化染色結(jié)果及其陽性面積百分比Figure 4 Immunohistochemical staining results of α-SMA and its positive area percentage in two groups of rats注：與對照組同一時間點比較，①P<0.05

2.6 血Bcl-3、Gal-3、TGF-β1與腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)性分析 CKD大鼠血Bcl-3、Gal-3、TGF-β1水平與腎間質(zhì)纖維化相對面積呈正相關(guān)(rs=0.776，P<0.001;rs=0.58，P<0.001;rs=0.52，P=0.001)，見圖5。

圖5 血Bcl-3、Gal-3、TGF-β1與腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis of blood Bcl-3,Gal-3,TGF-β1 and renal interstitial fibrosis

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病的主要病理改變，是腎臟疾病進展到終末期腎病的主要病因之一[6]，早期預(yù)防及干預(yù)腎纖維化是延緩腎衰竭的關(guān)鍵措施。腎間質(zhì)纖維化動物模型的造模方法主要分為手術(shù)(單側(cè)輸尿管結(jié)扎等)、藥物(腺嘌呤、環(huán)孢素A等)和其他[7]。本研究采用腺嘌呤灌胃制備CKD大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化下生成2,8-二羥基腺嘌呤,后者使腎小管發(fā)生堵塞,造成血清尿素氮、肌酐、尿酸顯著升高，尿酸形成結(jié)晶,在腎小管、間質(zhì)及腎小球部位沉積，導(dǎo)致大量腎單位損傷,最終發(fā)生腎間質(zhì)纖維化[7-8]。本研究中，HE染色結(jié)果提示CKD大鼠模型建立成功。Masson染色顯示CKD大鼠腎間質(zhì)有明顯的藍色膠原纖維沉積，纖維化相關(guān)標志物α-SMA的表達水平也較對照組明顯增加。由于腎臟纖維化主要由常駐成纖維細胞產(chǎn)生，而內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)分化可能是其主要來源，在轉(zhuǎn)分化期間，內(nèi)皮細胞獲得間充質(zhì)標志物α-SMA[9]。以上均證實腺嘌呤誘導(dǎo)CKD大鼠模型出現(xiàn)了腎間質(zhì)的纖維化。因此，在腺嘌呤灌胃制備CKD大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中探討B(tài)cl-3、Gal-3、TGF-β1與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。

TGF-β1家族蛋白是多功能細胞因子，在發(fā)育、炎癥、免疫和組織重塑和修復(fù)等多種生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵性的作用。且在腎纖維化中，TGF-β1是作用較為顯著的一種蛋白[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，當發(fā)生腎纖維化時，組織[10-12]、血清[13-14]和尿液[10,14-15]中的TGF-β1 水平明顯升高。Baczkowska等[16]研究發(fā)現(xiàn)血清TGF-β1 濃度可能預(yù)測腎移植術(shù)后患者腎纖維化的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)CKD大鼠各時間點的血清TGF-β1水平明顯高于對照組，且其水平與腎間質(zhì)纖維化之間呈正相關(guān)關(guān)系，表明隨著腎間質(zhì)纖維化的進展，TGF-β1表達水平也逐漸升高。其誘導(dǎo)腎纖維化的可能的機制包括[10]：①誘導(dǎo)膠原I等細胞外基質(zhì) (Extracellular matrix,ECM)的合成。②誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制物 (Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs) 的失衡，阻止ECM的降解。③對腎臟固有細胞的直接作用。④促進纖維細胞等多種來源的肌纖維化母細胞轉(zhuǎn)分化和增殖，介導(dǎo)纖維化反應(yīng)。Gal-3是β-半乳糖苷結(jié)合凝集素Galectin家族中30kDa的成員，參與了纖維化、心室重構(gòu)、癌癥以及自身免疫和炎癥等過程，具有多種生物學(xué)功能，是檢測各種疾病早期的潛在生物標記物[17-18]。盡管大量研究[17,19-20]發(fā)現(xiàn)Gal-3在腎纖維化過程中表達上調(diào)，可促進腎臟纖維化的發(fā)生，但針對血清Gal-3水平與腎纖維化的研究相對較少。研究[21]表明，較高的循環(huán)Gal-3水平與發(fā)生CKD的風(fēng)險增加和腎功能迅速喪失有關(guān)，而進行性CKD的發(fā)展將導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。Ou等[22]發(fā)現(xiàn)血漿Gal-3水平升高與腎纖維化風(fēng)險增加相關(guān)，并進一步證明了Gal-3與間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮和血管內(nèi)膜纖維化有關(guān)。其次，他們在RNA序列分析中發(fā)現(xiàn)Gal-3在纖維化腎活檢樣本中表達上調(diào)。最后，結(jié)合GO富集分析以及KEGG分析，認為Gal-3可能通過調(diào)節(jié)細胞間粘附和細胞增殖來促進腎纖維化過程。本研究發(fā)現(xiàn)CKD腎纖維化時血清Gal-3明顯升高，且與腎纖維化呈正相關(guān)，因此Gal-3有望成為腎纖維化的血清學(xué)標志物。

Bcl-3是IκB家族的成員，有報道稱Bcl-3可通過直接結(jié)合Smad3，保護Smad3蛋白免受泛素化和降解來調(diào)節(jié)TGFβ/Smad信號通路，從而參與腎纖維化[8,23]。而目前關(guān)于Bcl-3與腎纖維化的研究較少。Chen等[23]發(fā)現(xiàn)Bcl-3在UUO小鼠模型腎纖維化中顯著上調(diào)，且在CKD患者中，血清Bcl-3水平顯著高于健康對照組，并且與人附睪蛋白4(Human epididymis protein 4，HE4)的血清水平高度相關(guān)，而HE4是腎纖維化的生物標志物，因此他們推斷Bcl-3可以作為CKD腎纖維化的一個新的有價值的生物標志物。本研究亦發(fā)現(xiàn)CKD大鼠血清Bcl-3水平與腎間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)，且6周的Bcl-3水平較3周明顯升高，這表明Bcl-3可能不僅有助于評估腎纖維化，還可反應(yīng)其嚴重程度。

本研究存在一定的局限性，僅為小樣本的動物實驗，且只是初步觀察了CKD時血清TGF-β1、Gal-3和Bcl-3的變化及其與腎纖維化的關(guān)系，未能深入探討其變化價值，且未在臨床應(yīng)用中進一步驗證。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，在腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD大鼠模型中，血清TGF-β1、Gal-3和Bcl-3水平明顯增高，且與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，有望成為評估腎纖維化的新型生物標志物，未來還需要進一步的前瞻性、大樣本的研究來進一步證實本研究的結(jié)果以及TGF-β1、Gal-3和Bcl-3作為CKD患者腎纖維化生物標志物的潛在價值。