CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌預后判斷中的臨床應用

蔣婷婷 李和沛 王丹 李燕雛

(四川大學華西醫院 1.液體活檢和單細胞實驗室；2.頭頸腫瘤科；3.腫瘤放療科,四川 成都 610041)

目前，臨床常用的腫瘤標志物和影像學檢查難以發現早期腫瘤，而且不能準確動態監測病情發展，可能導致患者錯過最佳治療時機。液體活檢作為腫瘤早診、隨訪及預后判斷中的重要新型手段日漸成熟，當腫瘤細胞從實體腫瘤的原發灶或轉移灶中脫落后進入外周循環系統后即可形成單個的循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)或循環腫瘤癌栓(Circulating tumor microembolis,CTMs)。其中，循環腫瘤癌栓更有利于細胞之間的生物信息傳遞，更容易在血流剪切壓力下存活，導致惡性腫瘤復發或遠處轉移的風險更高[1-2]。“CTCs和CTMs”作為液體活檢最重要指標之一，其動態監測廣泛應用于腫瘤的早期篩查、診斷分期、療效評價、預后評估以及患者的個體化治療等方面，已在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多種實體腫瘤中得到證實[3-7]。臨床研究發現，鼻咽癌患者外周血中的CTCs數目可提示鼻咽癌的病情進展程度，動態監測CTCs的變化可對化療的療效進行及時有效的評估，CTCs不同亞型與化療敏感性和耐藥性相關[8-9]。另外，研究[10]也發現CTCs數量與血漿EBV-DNA表達量呈正相關。但目前關于聯合檢測CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌患者中的臨床意義尚不清楚，本文探討CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌患者診療中的變化情況，為局部晚期鼻咽癌臨床預后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入四川大學華西醫院自2018年6月～2021年1月收治的38 例局部晚期鼻咽癌患者。其中男28 例，女10 例，中位年齡44.1歲，平均(48.56±0.51)歲。病理分期和TNM分期參照美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版，其中納入Ⅲ期患者11例，Ⅳ期患者27例。納入標準：①經病理確診為局部晚期鼻咽癌。②既往無腫瘤病史，且無放化療治療史。③無血管、嚴重心臟、腎臟等疾病。④血常規及血生化參數在正常參考值范圍內。⑤ECOG評分0～1 分。本研究已獲四川大學華西醫院倫理委員會批準[倫理編號為：2015年審(141)號]，且所有受試者均自愿簽訂知情同意書。

1.2 方法 38例局部晚期鼻咽癌患者，首先接受了0～4周期誘導化療，具體方案為：吉西他濱+順鉑或多西紫杉醇+順鉑+氟尿嘧啶。隨后進行適型調強放射治療(Intensity Modulated Radiotherapy，IMRT)，放療期間根據患者個體差異情況給予同步化療(Concurrent chemoradiotherapy，CRT)，同步周期為0～3周期，使用單藥順鉑或尼妥珠單抗進行同步治療。

1.3 療效評價 治療效果評價標準根據實體瘤療效評價標準RECIST 1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,version 1.1)。完全緩解(Complete Response，CR)：腫瘤病灶完全消失。部分緩解(Partial Response，PR)：腫瘤病灶直徑之和比基線水平減少30%以上。疾病進展(Progressive Disease，PD)：腫瘤病灶直徑之和相對增加20%以上，直徑之和的絕對值增加5 mm以上，出現1 個或多個新病灶。疾病穩定(Stable Disease，SD)：腫瘤病灶增加程度介于PR與PD兩者之間。疾病控制(Disease Control，DC)：治療有效指疾病完全緩解、部分緩解和疾病穩定，即治療有效為：CR+PR+SD。治療無效為PD。CTCs療效評價標準：治療有效指治療后外周血中CTCs數量下降≥1/5治療前的CTCs數量，治療無效指治療后外周血中CTCs數量升高或不變>1/5治療前的CTCs數量[11]。

1.4 外周血CTCs/CTMs檢測方法 入組患者在治療前、誘導化療結束后1周和調強放射治療結束1月及1年后四個時間點分別采集患者肘靜脈血6 mL用于CTCs及CTMs檢測，置于含有ACD的抗凝真空管中(Becton,Dickinson and Company，NJ，USA)，避光低溫保存，于24 h內檢測，檢測操作過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。檢測試劑盒購于賽特生物醫藥科技有限公司，其試劑盒具體包括SE-CTC試劑盒(Cytointelligen，SanDiego，CA，USA)和iFISH 試劑盒(Cytointelligen，SanDiego，CA，USA)。SE-CTC試劑盒用于分離富集外周血中的CTCs和CTMs，iFISH 試劑盒用于鑒定判別分類CTCs和CTMs。上述實驗操作完成后在自動掃描平臺上進行自動掃描。CTCs的判讀標準：PD-L1+/CD31-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2或者PD-L1-/ CD31-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2；CTMs 的判讀標準：單個循環腫瘤細胞數量≥2個的CTCs 聚集成的細胞團[8,12]。在CTCs和CTMs采血的各個時間點同時檢測血漿 EBV-DNA 水平。

1.5 隨訪 截止2021年8月1日，入組患者在治療結束后，門診或電話定期隨訪，治療結束后半年內每個月隨訪一次，1～3 年內每三個月隨訪一次，3～5 年內每半年隨訪一次，5年后每年隨訪一次。隨訪終點為疾病出現進展或死亡。

1.6 統計學分析 采用IBM SPSS 26.0版本對數據進行分析，計量資料采用最小值、最大值、中位數及均數進行描述，計數資料之間的相關分析采用卡方檢驗，等級資料采用Spearman相關系數分析，定量資料之間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs和CTMs數目與病理特征的關系 38例初治局部晚期鼻咽癌患者外周血中檢出CTCs和CTMs細胞，見圖1，CTCs和CTMs的計數基線與患者的臨床病理特征的關系，見表1。基線分析可見，CTCs和CTMs的陽性檢出率與鼻咽癌患者的性別、年齡、ECOG評分和TNM分期均無關(P>0.05)。病理分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者的外周血中CTCs陽性檢出率Ⅳ期比Ⅲ期患者高18.2%。患者外周血中血漿EBV-DNA水平范圍為0.0～44700.0 copies/mL。采用Spearman相關系數分析CTCs和CTMs與EBV-DNA水平的相關性顯示，局部晚期鼻咽癌患者與血漿EBV-DNA 表達水平均無相關性(P>0.05)。值得關注的是，納入38例患者中，其中有5例患者EBV-DNA表達水平陰性，但這5例患者的外周血中均發現了CTCs，其中1 例患者外周血中還發現了CTMs，提示CTCs和CTMs可能在外周血中的檢測靈敏度更高。

圖1 CTCs和CTMs細胞Figure 1 CTCs and CTMs cells注：A.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體≥5體的CTC；B.由兩個EpCAM+的CTC組成的CTM

表1 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs和CTMs數目與臨床病理特征的關系[n(×10-2)]Table 1 The relationship between the number of baseline CTCs/CTMs and clinicopathological characteristic in patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma

2.2 局部晚期鼻咽癌患者CTCs和CTMs基線數目與放療靶區參數的相關性 納入患者在治療前CTCs基線數目檢出的范圍為0～21 個，治療前CTMs基線數目檢出的范圍為0～4 個。36例CTCs陽性患者中，腫瘤原發灶靶區(GTVnx)范圍為(52.07±30.14) cm3，淋巴結靶區(GTVnd)范圍為(30.95±19.94) cm3，大體腫瘤體積(GTV)范圍為(64.90±42.45) cm3；2例CTCs陽性患者中，GTVnx范圍為(47.31±26.74) cm3，GTVnd范圍為(13.82±8.16) cm3，GTV范圍為(63.37±27.17) cm3。采用Spearman相關系數分析結果顯示，入組患者治療前CTCs數目與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關性(P=0.478，P=0.647，P=0.077)。同樣，CTMs與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關性(P=0.254，P=0.687，P=0.082)。

2.3 局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs與治療效果的關系 對在納入患者中20例進行了治療前、誘導化療結束后1周和調強放射治療結束1月及1年后進行了四個采血時間點的動態監測。分析20 例患者外周血中CTCs動態變化情況，按照CTCs評價標準判定，16 例有效，4 例無效。CTCs數目在四個時間點的數目分別為：(9.7±10.3)個、(5.40±6.4)個、(2.3±7.1)個和(1.5±3.4)個，經過治療后CTCs總數較治療前明顯降低(P=0.0241)。進一步分析，CTMs數目四個時間點的數目分別為：(2.5±2.1) 個、(2.4±1.5)個、(0±3.1)個和(0±0.9)個，經過治療后CTMs較治療前降低(P=0.431)。②按照RECIST 1.1標準，上述20 例患者中，17 例患者治療后DCR率為85.0%(17/20)，PD率為15.0%(3/20)。CR、PR或SD患者CTCs數目在治療前為(9.8±5.7)個，治療后下降為(2.4±6.2)個；CTMs數目在治療前為(2.9±1.2)個，治療后下降至(1.4±0.2)個。另外，3例PD患者CTCs數目在治療前為(14.2±3.9)個，治療后降為(3.7±4.2)個；CTMs數目在治療前為(2.9±1.2)個，治療后下降至(1.4±2.2)個。結果提示，局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs數目的動態變化情況與治療后的療效密切相關，PD患者治療后的CTCs和CTMs數目更高，治療效果更差。③采用Fisher檢驗比較CTCs評價標準和RECIST 1.1評價標準，兩種療效評價方式差異無統計學意義(2=3.821，P=0.557)。局部晚期鼻咽癌患者CTCs數目與治療效果的關系，見表2。

表2 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs數目與治療效果的關系[n(×10-2)]Table 2 The relationship between baseline CTCs number and treatment effect in patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma

2.4 局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs各亞型在治療過程中的分布情況 分析動態監測的20例患者在治療過程中CTCs各個亞型變化的情況(見圖2)。三倍體CTCs四個時間點的檢出百分比分別為：75.9%、59.3%、41.3%和5.7%；四倍體CTCs在四個時間點的檢出百分比分別為：68.1%、30.3%、20.1%和18.6%；≥五倍體CTCs在四個時間點的檢出百分比分別為：43.0%、37.0%、20.6%和20.5%。隨訪患者CTCs從治療前到治療后動態變化情況可見，三倍體、四倍體和≥五倍體CTCs分別下降了70.2%、49.5%和22.5%。經治患者中，三倍體CTCs對化療或者放療更為敏感，而≥五倍體的CTCs可能和耐藥相關，具體機制需要進一步驗證。

圖2 患者外周血中CTCs亞型分布情況統計圖(n=20)Figure 2 Distribution of CTCs subtypes in patients 注：CTCs各亞型百分比計算方式為：各亞型個數/CTCs總數×100%

進一步分析發現，2例患者在治療前檢出表達PD-L1陽性CTCs，且均為病情進展(PD)患者。對其分型發現，1例患者血液樣本中，有一個三倍體CTC細胞表達PD-L1陽性；1 例患者有一個≥五倍體CTCs細胞表達PD-L1陽性。上述結果提示，外周血中出現表達PD-L1陽性CTCs提示預后不良。

3 討論

鼻咽癌常見于中國南方和東南亞等地區，發病與環境、地理位置、遺傳因素、EB病毒等因素有關[13-14]。據統計，僅不足1/3鼻咽癌患者可在早期確診，約2/3患者確診已是局部晚期。局部復發、局部未控和遠處轉移是導致鼻咽癌患者死亡的主要原因。目前，常規鼻咽癌的診斷及隨訪主要依賴于病理組織、血清腫瘤標志物和醫學影像等檢查。CTCs/CTMs作為一種新型、敏感監測指標有助腫瘤的早期診斷、實時動態檢測、判斷療效和預后評估。

外周血中CTCs和CTMs是實體瘤的“液體活檢”的重要組成，具有取材方便、多次反復取材和無創傷等優點[15-17]。既往循環腫瘤細胞在鼻咽癌的研究主要集中于外周血中CTCs 的陽性率與TNM分期間的相關性，Zhang等[8]報道，CTCs陽性檢出率與TNM分期無顯著相關性；He等[18]在納入的33 例鼻咽癌研究中發現CTCs 計數與腫瘤負荷成正相關性。本研究發現，在入組的38 例局部晚期的鼻咽癌患者中，Ⅲ期和Ⅳ期患者CTCs陽性檢出率分別高達81.8%以上，Ⅳ期患者比Ⅲ期患者CTCs陽性檢出率高18.2%，提示腫瘤分期越晚，CTCs計數越高，腫瘤的負荷也越大。另外，本文進一步分析納入的38 例治療前局部晚期鼻咽癌患者CTCs陽性檢出率與放療靶區參數的相關性，發現入組患者治療前CTCs和CTMs數目與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關性。雖然以上述分析均為陰性結果，但CTCs陽性的局部晚期鼻咽癌患者治療前勾畫的GTV范圍均比CTCs陰性的患者勾畫的范圍更廣，提示臨床醫生可參考CTCs檢出情況來進一步作出精準的范圍選擇。

Si等[19]研究發現，鼻咽癌患者治療中CR或PR患者，外周血中的CTCs數目明顯降低。本研究不僅分析20 例局部晚期鼻咽癌患者在治療過程中外周血CTCs和CTMs數目的動態變化，更進一步分析了CTCs的各個亞型變化情況。患者經過治療后，發現局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs數目的動態變化情況與治療后的療效密切相關，與CR、PR或SD組患者相比較，3 例PD患者治療后的CTCs和CTMs檢出率更高，治療效果更差。上述結果提示，PD患者治療后CTCs患者更容易產生耐藥，治療結束后更應該加強隨訪，防止腫瘤的復發和進一步轉移。不同的亞型的CTCs具有不同的臨床意義，不同亞型在不同腫瘤中具有明顯異質性[20-24]。本研究發現，三倍體、四倍體及≥五倍體CTCs從治療前到治療后逐步下降，各亞型CTCs數目下降從高到低依次分別是三倍體CTCs、四倍體CTCs和≥五倍體CTCs。上述結果提示，≥五倍體的CTCs在治療過程中可能存在耐藥。進一步可見，本研究中表達PD-L1 CTCs的兩例患者均出現病情進展，提示CTCs中表達PD-L1可能是預后不良因素之一。有研究顯示，鼻咽癌病理組織中PD-L1陽性率高可95%，癌巢周圍有大量的浸潤性T淋巴細胞，因此，針對PD-L1靶點的PD-1抗體聯合化療治療鼻咽癌的臨床試驗發現，卡瑞利珠單抗單藥用于PD-L1表達陽性的鼻咽癌患者具有較高的抗腫瘤活性且安全性可控。提示局部晚期鼻咽癌聯合應用PD-1單抗類抗腫瘤藥物具有可期的療效。

4 結論

CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌病程及治療過程中均有較高的檢出率，并表現出顯著差異，因此CTCs和CTMs可以用于局部晚期鼻咽癌動態監測、評估療效及指導預后判斷，將可根據檢測結果制定精準化的治療方案，及早采取對應的臨床干預措施。