新型冠狀病毒快速與普通核酸檢測系統的臨床組合應用研究*

朱艷秋 張攀 褚明亮 王莎 胡棉

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科，貴州 貴陽 550001)

新型冠狀病毒(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)具有非常強的傳染性[1-5]。加大檢測力度，對于及時發現并切斷病毒傳播至關重要。新冠核酸檢測的方法以熒光PCR法為主，其檢測時間在1.5～2 h之間。加上采樣時間，核酸提取時間及其他因素等，傳統的核酸檢測時間多在6 h以上。早發現、早隔離、及時阻斷病毒的傳播、縮短核酸檢測時間非常重要[6]。國內外近期研發了一系列快速核酸檢測系統(含試劑、儀器等)，并陸續進入臨床應用[7-8]。本研究比較了某品牌的快速檢測系統與普通檢測系統在新冠核酸擴增敏感性及時間上的差異，為臨床檢測應用提供部分參考依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 普通檢測系統：病毒采樣管(粵深械備20200187)；核酸提取(磁珠法)試劑盒(陜西械備20140007)；普通新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(國械注準20203400063)；磁珠法核酸提取儀(西安天隆科技有限公司，型號：NP968-C)；普通熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司，型號：SLAN-96P)?？焖贆z測系統：直接裂解法(粵穗械備20200113)；快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(國械注準20203400749)；快速熒光定量PCR儀(國械注準20203220748)。新型冠狀病毒液體質控品(北京康徹思坦生物技術有限公司，型號：S1，濃度25000 cp/mL)。

1.2 核酸提取方法

1.2.1 核酸提取法 將新冠核酸質控品S1(濃度25000 cp/mL)，用病毒采樣管中的保存液作為稀釋液，分別稀釋到200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。按照操作要求，使用核酸提取法試劑盒(qEx-DNA/RNA)在磁珠法核酸提取儀(NP968-C)上進行提取。提取得到的核酸RNA，-80℃保存待用。以上操作，每個濃度的樣品重復3次。

1.2.2 直接裂解法 將新冠核酸質控品S1(濃度25000 cp/mL)，用裂解釋放劑中的裂解液作為稀釋液，分別稀釋到200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。按照直接裂解法的說明要求，震蕩裂解釋放15 min，-80℃保存待用。以上操作，每個濃度的樣品重復3次。

1.3 熒光PCR擴增

1.3.1 核酸提取法/直接裂解法+普通擴增試劑+普通熒光定量PCR儀器 將1.2.1核酸提取法和1.2.2 核酸直接裂解法得到的RNA，各取5 μL，分別加入普通新型冠狀病毒核酸檢測試劑中，在普通熒光定量PCR儀(SLAN-96P)上進行擴增。FAM和/或VIC通道的Ct 值≤40，且有擴增曲線時，判為N基因和/或ORF1ab基因陽性(+)；FAM和/或VIC通道的Ct 值位于40～45之間，但有明顯擴增曲線，則進行復檢，復檢結果一致則判為N基因和/或ORF1ab基因弱陽性(±)。

1.3.2 核酸提取法/直接裂解法+快速擴增試劑+普通熒光定量PCR儀器 將1.2.1核酸提取法和1.2.2 核酸直接裂解法得到的RNA，各取5 μL，分別加入快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑中，在普通熒光定量PCR儀(SLAN-96P)上進行擴增。FAM和/或VIC通道的Ct 值≤30，且有擴增曲線時，判為N基因和/或ORF1ab基因陽性(+)；FAM和/或VIC通道的Ct 值位于30～32之間，但有明顯擴增曲線，則進行復檢，復檢結果一致則判為N基因和/或ORF1ab基因弱陽性(±)。

1.3.3 核酸提取法/直接裂解法+快速擴增試劑+快速熒光定量PCR儀器 將1.2.1核酸提取法和1.2.2 核酸直接裂解法得到的RNA，各取5 μL，分別加入快速新型冠狀病毒核酸檢測試劑中，在快速熒光定量PCR儀(AGS8830-16)上進行擴增。判斷標準同1.3.2。

1.4 統計學分析 采用等級資料秩和檢驗進行統計，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 核酸提取法和直接裂解法兩種方法核酸擴增結果的比較

2.1.1 以普通擴增試劑及普通熒光定量PCR儀器為基準，比較核酸提取法和直接裂解法兩種方法的擴增結果 樣本的初始濃度為2000 cp/mL和1000 cp/mL時候，核酸提取法和裂解釋放提取法兩種方法PCR的結果都顯示有明顯的擴增曲線，核酸的N基因(藍色曲線)和ORF1ab 基因(綠色曲線)，都為陽性。當樣本的初始濃度為500 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結果顯示N基因和ORF1ab 基因陽性；而裂解釋放提取法PCR的結果N基因為弱陽性，ORF1ab 基因為陰性。當樣本的初始濃度為200 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結果顯示N基因陽性，ORF1ab 基因弱陽性；而裂解釋放提取法PCR的結果N基因和ORF1ab 基因均為陰性(見圖1)。兩種方法在200 cp/mL和500 cp/mL濃度中差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 核酸提取法和直接裂解法得到的核酸在普通擴增試劑及普通熒光定量PCR儀器上擴增得到的結果 Figure 1 Amplification results between nucleic acid extraction method and direct lysis method using common amplification reagent and common RT PCR instrument 注：樣本的初始濃度分別為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。藍色曲線表示N基因，綠色曲線表示ORF1ab基因

2.1.2 以快速擴增試劑及普通熒光定量PCR儀器為基準，比較核酸提取法和直接裂解法兩種方法的擴增結果 樣本的初始濃度為2000 cp/mL和1000 cp/mL時候，核酸提取法和裂解釋放兩種方法PCR結果顯示，核酸的N基因(藍色曲線)和ORF1ab基因(綠色曲線)都為陽性或弱陽性。當樣本的初始濃度為500 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結果顯示N基因和ORF1ab基因為陽性；而裂解釋放法PCR的結果顯示N基因為弱陽性，ORF1ab 基因為陰性。當樣本的初始濃度為200 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結果N基因為陽性，ORF1ab基因為陰性；而裂解釋放法PCR的N基因和ORF1ab基因均為陰性(見圖2)。兩種方法在200 cp/mL和500 cp/mL濃度中差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 核酸提取法和直接裂解法得到的核酸在快速擴增試劑及普通熒光定量PCR儀器上擴增得到的結果Figure 2 Amplification results between nucleic acid extraction method and direct lysis method using rapid amplification reagent and common RT PCR instrument注：樣本的初始濃度分別為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL和2000 cp/mL。藍色曲線表示N基因，綠色曲線表示ORF1ab基因

2.1.3 以快速擴增試劑及快速熒光定量PCR儀器為基準，比較核酸提取法和直接裂解法兩種方法的擴增結果 樣本的初始濃度為2000 cp/mL和1000 cp/mL時候，核酸提取法和裂解釋放兩種方法PCR結果顯示，核酸的N基因(黑色曲線)和ORF1ab基因(黃色曲線)都為陽性。當樣本的初始濃度為500 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結果顯示N基因和ORF1ab基因為陽性；而裂解釋放法的N基因為陽性，ORF1ab基因為陰性。當樣本的初始濃度為200 cp/mL時候，核酸提取法PCR的結果顯示N基因陰性，ORF1ab基因陽性；而裂解釋放法PCR結果的N基因和ORF1ab基因均為陰性(見圖3)。兩種方法在200 cp/mL和500 cp/mL濃度中差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 核酸提取法和直接裂解法得到的核酸在快速擴增試劑及快速熒光定量PCR儀器上擴增得到的結果 Figure 3 Amplification results between nucleic acid extraction method and direct lysis method using rapid amplification reagent and rapid RT PCR instrument注：樣本的初始濃度分別為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL。黃色曲線表示N基因，黑色色曲線表示ORF1ab 基因

2.2 普通擴增試劑和快速擴增試劑的比較

2.2.1 以核酸提取法提取的核酸及普通熒光定量PCR儀器為基準，比較普通擴增試劑和快速擴增試劑的擴增結果 樣本的初始濃度為500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通擴增試劑和快速擴增試劑兩種試劑PCR結果的N基因和ORF1ab基因都為陽性。當樣本濃度為200 cp/mL時候，普通擴增試劑PCR結果的N基因為陽性，ORF1ab基因為弱陽性；而快速擴增試劑PCR結果的N基因為陽性，ORF1ab基因為陰性(見圖1核酸提取法和圖2核酸提取法)。兩種方法之間僅在200 cp/mL濃度中差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2.2 以直接裂解法的核酸及普通熒光定量PCR儀器為基準，比較普通擴增試劑和快速擴增試劑的擴增結果 樣本的初始濃度為200 cp/mL、500 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通擴增試劑和快速擴增試劑兩種試劑PCR結果完全一致，都為陰性、弱陽性或陽性。當樣本濃度為1000 cp/mL時候，普通擴增試劑PCR結果的N基因和ORF1ab基因均為陽性；而快速擴增試劑PCR結果的N基因為陽性，ORF1ab基因為弱陽性(見圖1裂解釋放法和圖2裂解釋放法)。兩種方法之間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的比較

2.3.1 以核酸提取法提取的核酸及快速擴增試劑為基準，比較普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的擴增結果 樣本的初始濃度為500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器兩種儀器的結果完全一致，都為陽性。當樣本濃度為200 cp/mL時候，普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的PCR結果的N基因和ORF1ab基因或者陽性或者陰性(見圖2核酸提取法和圖3核酸提取法)。兩種方法之間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3.2 以直接裂解法的核酸及快速擴增試劑為基準，比較普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器的擴增結果 樣本的初始濃度為200 cp/mL、500 cp/mL、1000 cp/mL、2000 cp/mL的時候，普通熒光定量PCR儀器和快速熒光定量PCR儀器兩種儀器的結果基本一致，都為陰性、弱陽性或陽性(見圖2裂解釋放法和圖3裂解釋放法)。兩種方法差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 不同試劑、儀器及提取方法核酸檢測時間的比較 核酸提取法需要18 min，直接裂解法需要15 min。普通擴增試劑在普通PCR儀器上擴增時間為116 min，快速擴增試劑在普通PCR儀器上擴增時間為69 min，快速擴增試劑在快速PCR儀器上擴增時間為41 min。因此，理論上最快的檢測時間為56 min(41 min+15 min)，最慢的檢測時間為134 min(116 min+18 min)。而核酸提取法+快速擴增試劑+快速PCR儀器擴增時間的理論最快時間為59 min。僅僅比直接裂解法的總時長56 min多出3 min時間。

3 討論

新冠核酸檢測對于及時發現傳染源、降低疫情擴散風險具有重要意義[9-11]。國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯防聯控機制醫療救治組要求規范檢測技術[12-13]并要求使用高靈敏度的試劑(檢測限≤500 cp/mL)并提高新冠核酸檢測的時效性?？焖貾CR可以在更短時間內完成對核酸分子的擴增。近年來快速PCR技術從核酸擴增試劑(PCR聚合酶的改進、添加劑的開發)和熱循環儀的革新創造等方面進行了大量卓有成效的研究[14-19]。

本研究的新冠核酸快速檢測系統，由直接核酸裂解釋放試劑、快速擴增試劑和快速熒光定量PCR儀組成。其快速熒光定量PCR儀(AGS 8830)和快速擴增試劑可縮短整個實驗擴增時間到41 min；并且樣本的核酸提取直接簡化為裂解釋放提取法。直接裂解法在臨床DNA核酸提取檢測方面有著廣泛的應用，如乙型肝炎病毒[20]、結核分枝桿菌[21-22]、EB病毒[23]等；但同時也發現，直接裂解釋放提取的RAN很容易降解，不適用于丙型肝炎病毒、新冠等RNA核酸的檢測[24-27]。楊超杰等[25]特意比較了臨床常用的新冠核酸提取方法，發現直接裂解法(一步法)雖步驟簡單，但漏檢率高，不建議臨床使用。本實驗亦表明，如果使用直接裂解法，配合普通/快速擴增試劑和普通/快速熒光PCR儀器，其敏感性均較差，不能滿足臨床最低檢測限≤500 cp/mL的疫情防控要求(醫療機構新冠核酸檢測工作手冊(試行第二版2020.12.30)。而如果使用核酸提取法，配合普通/快速擴增試劑和普通/快速熒光PCR儀器，其敏感性均較好，可以滿足檢測限≤500 cp/mL的要求。實驗亦發現普通擴增試劑和快速擴增試劑在500 cp/mL濃度的時候，沒有差異；在200 cp/mL時候快速擴增試劑敏感性高于普通擴增試劑，這可能與此時配套使用的是快速熒光PCR儀器相關。而普通熒光PCR儀器和快速熒光PCR儀器之間的比較，發現在檢測敏感性之間沒有顯著差異。以上說明，該快速檢測系統中，快速擴增試劑和快速熒光PCR儀器的技術成熟穩定，但是直接裂解法效果不佳。因此，實踐中，應該使用核酸提取法配合使用快速擴增試劑和快速熒光PCR儀器，這樣其總檢測時間可以從傳統方法的134 min縮短為59 min，且能滿足檢測限≤500 cp/mL的防控要求。

4 結論

在臨床實踐中，不建議使用直接裂解法提取核酸。但是可以使用某些適配性廣的快速擴增試劑和快速熒光定量PCR儀，從而縮短檢測時間，滿足臨床防控要求。