三陰性乳腺癌組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

高平發(fā)，吳煒，馮東旭，谷佃寶，費(fèi)哲為

上海健康醫(yī)學(xué)院附屬崇明醫(yī)院甲乳外科，上海 202150

乳腺癌是女性發(fā)病率最高、致死率第二的惡性腫瘤［1］。三陰性乳腺癌（TNBC）是一種特殊類型的乳腺癌，占所有乳腺癌的10.0%～20.8%。由于雌激素受體、孕激素受體以及表皮生長(zhǎng)因子受體2（Her-2）表達(dá)均為陰性，TNBC缺乏有效的治療靶點(diǎn)，目前的治療策略仍以化療為主，治療效果較差［2-3］。因此，深入研究TNBC 的發(fā)病機(jī)制可能對(duì)探索新的治療策略具有重要意義。表觀遺傳改變，如DNA 甲基化和組蛋白翻譯后修飾，已被證實(shí)能夠影響基因的表達(dá)［4］。組蛋白翻譯后修飾包括磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化等，這些修飾方式均與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。組蛋白H3 第4 位賴氨酸三甲基化（H3K4me3）是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，能夠?qū)е履[瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄激活。組蛋白H3 第9 位賴氨酸殘基乙酰化（H3K9ac）作為轉(zhuǎn)錄激活劑，能夠增強(qiáng)多種信號(hào)通路而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。有研究報(bào)道，乳腺癌組織H3K4me3、H3K9ac 高表達(dá)，其高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)［6］。本研究探索了TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016 年1 月—2019 年4 月上海健康醫(yī)學(xué)院附屬崇明醫(yī)院收治的TNBC 患者145例。TNBC 診斷依據(jù)《中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）乳腺癌診療指南》，并經(jīng)術(shù)后病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性TNBC 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②單側(cè)發(fā)病；③初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；④接受乳腺癌改良根治術(shù)+腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；②合并其他部位腫瘤者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；④妊娠期或哺乳期。患者年齡32～62 歲，其中≤50 歲84 例、＞50 歲61 例；絕經(jīng)41例，未絕經(jīng)104例；腫瘤直徑≥2 cm 56例，腫瘤直徑＜2 cm 89例；病理類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌109例，浸潤(rùn)性小葉癌10例，髓樣癌5例，其他癌21例；T分期：T1期58例，T2～T4期87例；N分期：N0期49例，N1、N2期96 例；組織分化程度：高分化62 例，中分化54 例，低未分化29例。本研究經(jīng)上海健康醫(yī)學(xué)院附屬崇明醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：20162104），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 H3K4me3、H3K9ac、Ki-67表達(dá)檢測(cè) 采用PV-6000 二步法行免疫組化染色。取手術(shù)切除的TNBC組織，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4～6 μm 厚連續(xù)切片。切片57～60 ℃烤片60 min，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中，置于微波爐中加熱修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫。經(jīng)正常山羊血清封閉后，分別滴加H3K4me3、H3K9ac、抗Ki-67 多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。次日，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育60 min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。

結(jié)果判定：H3K4me3、H3K9ac 陽性染色均定位于細(xì)胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒。染色強(qiáng)度評(píng)分：以陽性細(xì)胞呈色反應(yīng)為準(zhǔn)，無色為0 分，淺黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍不重疊視野，計(jì)數(shù)每視野陽性細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：≤10%為0 分，＞10%～25%為1 分，＞25%～50%為2分，＞50%為3 分。根據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞比例半定量分析，染色程度評(píng)分與陽性細(xì)胞比例評(píng)分乘積≥1 為陽性表達(dá)，其中二者乘積0～3 為低表達(dá)、4～6為高表達(dá)。Ki-67陽性染色定位于細(xì)胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒。Ki-67 表達(dá)強(qiáng)度采用陽性細(xì)胞比例評(píng)估。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍不重疊視野，計(jì)數(shù)每視野陽性細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為陰性，＞5%～10%為弱陽性，＞10%～50%為陽性，＞50%為強(qiáng)陽性。

1.3 隨訪 所有研究對(duì)象出院后以電話形式定期隨訪3 年，出院后第1 年每3 個(gè)月隨訪1 次，之后每6個(gè)月隨訪1次，以患者死亡或隨訪3年結(jié)束為隨訪終點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)情況 145例份TNBC 組織中，H3K4me3 高表達(dá)84 例份、低表達(dá)61例份，H3K9ac高表達(dá)78例份、低表達(dá)67例份。

2.2 TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 TNBC組織H3K4me3和H3K9ac表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.3 TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與Ki-67 表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)秩和檢驗(yàn)，隨著Ki-67 表達(dá)強(qiáng)度增加，TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 陽性表達(dá)逐漸增多（Z分別為3.630、3.168，P均＜0.05），見表2。

表2 TNBC組織H3K4me3、H3K9ac表達(dá)與Ki-67表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系［例（%）］

2.4 TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 TNBC組織H3K4me3高表達(dá)者與低表達(dá)者3年累積生存率分別為60.7%、78.7%，TNBC組織H3K4me3高表達(dá)者3年累積生存率顯著低于其低表達(dá)者（χ2=3.023，P＜0.05）；TNBC組織H3K9ac高表達(dá)者與低表達(dá)者3 年累積生存率分別為58.3%、82.0%，TNBC組織H3K9ac高表達(dá)者3年累積生存率顯著低于其低表達(dá)者（χ2=3.023，P＜0.05）。

3 討論

TNBC是一種雌激素受體、孕激素受體以及Her-2表達(dá)均為陰性的乳腺癌。流行病學(xué)調(diào)查顯示，TNBC多發(fā)生于40歲以下的絕經(jīng)前女性［7］。與其他類型乳腺癌相比，TNBC易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，病情進(jìn)展迅速，并且缺乏有效的治療靶標(biāo)，預(yù)后較差。目前，TNBC發(fā)病的分子機(jī)制仍不十分清楚。因此，深入研究TNBC的發(fā)病機(jī)制可能對(duì)探索新的治療策略具有重要意義。

表觀遺傳是指DNA 序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。表觀遺傳改變，如DNA甲基化和組蛋白翻譯后修飾等，通常發(fā)生在腫瘤發(fā)展的早期階段［8］。組蛋白修飾是指組蛋白在相關(guān)酶作用下發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化等修飾過程，在過去幾年中引起了較大關(guān)注。組蛋白修飾發(fā)生在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，翻譯后可調(diào)節(jié)DNA 的結(jié)構(gòu)和復(fù)制，在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用［9］。異常組蛋白修飾可導(dǎo)致基因表達(dá)和細(xì)胞整體代謝狀態(tài)改變，從而引起多種疾病。已有研究證實(shí)，組蛋白甲基化、乙酰化與乳腺癌的關(guān)系非常密切［10］。H3K4me3 處的三甲基化是一種翻譯后組蛋白修飾，H3K4me3 異常可導(dǎo)致表觀遺傳改變，這些表觀遺傳改變能夠引起腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)變化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［11］。有研究報(bào)道，H3K4me3 改變能夠激活與乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)的基因，從而促進(jìn)乳腺的發(fā)生、發(fā)展［12］。組蛋白乙酰化可通過中和組蛋白的正電荷來改變靜電荷，組蛋白尾部整體乙酰化可減少堿性賴氨酸殘基與帶負(fù)電荷DNA的靜電作用。因此，組蛋白乙酰化可誘導(dǎo)常染色質(zhì)形成，使常染色質(zhì)變得更加開放，使基因轉(zhuǎn)錄變得活躍，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。H3K9ac作為轉(zhuǎn)錄激活劑，能夠增強(qiáng)多種信號(hào)通路而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。有研究報(bào)道，乳腺癌組織H3K4me3、H3K9ac高表達(dá)，其高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)［6］。但目前關(guān)于TNBC組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究結(jié)果顯示，145 例份TNBC 組織中，H3K4me3 高表達(dá)84 例份、低表達(dá)61 例份，H3K9ac高表達(dá)78 例份、低表達(dá)67 例份，提示TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 高表達(dá)，與以往在乳腺癌中的報(bào)道一致［6］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)均與T 分期、N 分期和組織分化程度有關(guān)，而與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、病理類型無關(guān)。結(jié)果提示，H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與TNBC 侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)與Ki-67 表達(dá)強(qiáng)度關(guān)系的分析中，隨著Ki-67 表達(dá)強(qiáng)度增加，TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 陽性表達(dá)逐漸增多。進(jìn)一步證實(shí)H3K4me3、H3K9ac 高表達(dá)與TNBC 進(jìn)展密切相關(guān)，與KAUKONEN 等［13］研究報(bào)道一致。生存分析發(fā)現(xiàn)，TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 高表達(dá)者3 年累積生存率均顯著低于其低表達(dá)者，提示H3K4me3、H3K9ac 高表達(dá)與TNBC 患者預(yù)后不良有關(guān)。以上研究結(jié)果提示，抑制H3K4me3、H3K9ac 表達(dá)有望成為改善TNBC 預(yù)后的策略之一［14-16］。

綜上所述，TNBC 組織H3K4me3、H3K9ac 高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后不良密切相關(guān)。