2型固有淋巴細胞及其相關因子在支氣管肺發育不良中的變化及意義

王倩文 朱玥 王秋霞 盧紅艷

（江蘇大學附屬醫院兒科，江蘇鎮江 212000）

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是胎齡<32周早產兒常見的慢性肺疾病，治療難度大，死亡風險高，部分甚至影響兒童肺功能［1-3］。隨著新生兒重癥監護技術不斷提高，極低、超低出生體重兒存活率上升，BPD發生率呈上升趨勢。因此，對BPD的早期預警及防治刻不容緩。

肺泡-毛細血管屏障的完整性對維持正常血氧至關重要，出生后肺的免疫環境及先天免疫信號如何影響早期肺泡發育尚不明確。研究發現，出生后肺的膨脹與肺泡Ⅱ型上皮細胞（type Ⅱalveolar epithelial cell，AECⅡ）上調白細胞介素（interleukin，IL） -33有關［4］。AECⅡ在出生后分泌IL-33，肺內IL-33迅速增加，導致2型固有淋巴細胞（group 2 innate lymphoid cell，ILC2）活化和增殖，在生后早期塑造肺內2型免疫環境［5］。ILC2作為固有淋巴細胞的一種，主要聚居于肺黏膜等組織。出生后早期產生的ILC2構成了成年小鼠肺組織中總ILC2的大部分［6］，這提示新生兒期是ILC2發育的關鍵時期。病理情況下，氣道受到外界因素刺激，過度活化的ILC2分泌大量IL-5和IL-13，增強Th2免疫反應，導致肺損傷［7］。目前發現，IL-33、IL-25及胸腺基質淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）均可作為ILC2上游激活因子［8］。IL-33作為一種膜相關的促炎細胞因子，在內皮和上皮損傷、細胞凋亡和壞死方面起警報作用［9］。IL-25通過增強氣道平滑肌細胞的增殖活性引起氣道重塑［10］。TSLP可引起呼吸道Th2免疫反應，導致氣道炎癥和氣道重塑［11］。動物實驗發現，脂多糖誘導的BPD小鼠肺組織ILC2及IL-33明顯增加［12］；臨床研究發現，生后1 d、14 d及28 d血清IL-33升高與BPD發生及嚴重程度密切相關［13］，臍血 IL-33 不能預測BPD 發生［9］，然而 7 d IL-33水平與BPD的關系、ILC2和其他相關細胞因子在BPD患兒中的變化及意義尚未有研究。本研究通過檢測BPD與非BPD早產兒生后1 d、7 d及14 d外周血ILC2及其相關細胞因子IL-33、IL-25、TSLP、IL-5及IL-13水平，初步探討ILC2及其相關細胞因子在BPD中的變化及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

選擇2020年9月—2021年12月在江蘇大學附屬醫院兒科住院，胎齡<32周且住院時間≥14 d的76例早產兒為研究對象。排除標準：（1）合并嚴重的先天發育畸形；（2）合并遺傳代謝性疾病和/或染色體病；（3）住院期間放棄治療或死亡；（4）病例資料缺失；（5）未獲得知情同意。按照BPD診斷標準分為BPD組（n=30）及非BPD組（n=46）。BPD診斷參考2018年BPD診斷標準［14］：胎齡<32周的早產兒在校正胎齡36周時仍依賴不同程度的吸入氣氧濃度和呼吸支持≥3 d，并且有影像學資料證實存在肺間質病變，即可診斷為BPD。本研究已獲得江蘇大學附屬醫院醫學委員會批準（SWYXLL20200121-17）。

1.2 臨床資料收集

收集研究對象的臨床資料，包括：胎齡、出生體重、性別、肺泡表面活性物質的使用、出生方式、產前類固醇激素使用等情況。

1.3 樣本量估算

以ILC2占淋巴細胞百分率為主要指標，基于文獻［15］和本課題組預試驗結果發現2個隨機化組之間的ILC2占比差值為0.1%，并將檢驗效能定為80%，Ⅰ型錯誤率定為0.05，得出的樣本量為每組25例。預估約20%早產兒由于各種原因，其數據不能進行統計分析，為保證樣本量充足，故每組納入至少30例早產兒。樣本量計算公式按照文獻［16］，即N=公式中N為每組所需的最小樣本量；Uα規定為單側α=0.05所對應的U界值（1.6449）；Uβ取β=0.1所對應的U界值（1.6449）；δ為容許誤差，即隨機化組之間的ILC2占淋巴細胞百分率的差值（0.1%）；σ為總體標準差。由于查找文獻沒有得到總體標準差，由預試驗樣本標準差（0.12%）代替。k=1時兩組樣本量相等。

1.4 流式細胞術檢測外周血ILC2比例

于患兒生后1 d、7 d及14 d，收集外周靜脈血1.5 mL，肝素鈉抗凝，其中0.5 mL用于患兒住院過程中血常規、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）監測。另外1 mL室溫放置30 min后3 000 r/min離心30 min，離心后的血細胞沉淀采用Ficoll（天津灝洋TBD）密度梯度離心法提取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），細胞總量1×106~5×106個。分離出的PBMC中分別加入PerCP/Cy5-CD45抗體、FITC-Lin抗體、PE-CRTH2抗體、PE/Cy7-CD161抗體和APC-CD127抗體，充分混勻，4℃條件下避光孵育30 min，PBS重懸，4℃下2 000 r/min離心5 min洗掉多余抗體，再次加入300 μL PBS重懸，轉移入流式管內于FACSCanto（美國BD公司）流式機內檢測，以出現CD45+Lin-CRTH2+CD161+CD127+的細胞［17-18］定義為ILC2，結果采用FlowJo V10軟件進行分析。

1.5 外周血IL-33、IL-25、TSLP、IL-5和IL-13水平的檢測

上述早產兒生后1 d、7 d及14 d外周靜脈血離心后的血清置入-80℃冰箱保存統一檢測。采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法檢測外周血IL-33、IL-25、TSLP、IL-5和IL-13水平，按說明書（武漢艾萊特生物技術有限公司，中國）在450 nm處測量光密度值。橫坐標為光密度值，縱坐標為標準品濃度。構建標準曲線，計算每孔細胞因子濃度。

1.6 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。正態分布計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。計數資料采用例數和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。以是否為BPD作為因變量，控制對BPD發生影響較大的一般臨床資料，以兩組比較差異有統計學意義的細胞因子作為自變量行多因素logistic回歸分析。采用受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲線計算外周血ILC2、IL-33、TSLP及IL-5預測BPD的曲線下面積（area under the curve，AUC）、靈敏度和特異度等。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較

共收集符合標準的早產兒76例，其中BPD組30例（39%），非BPD組患兒46例（61%）。BPD組胎齡及出生體重低于非BPD組（P<0.001），兩組性別、出生方式、肺表面活性物質使用、產前類固醇激素使用方面比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 BPD組和非BPD組患兒一般情況比較

2.2 兩組外周血PBMC中ILC2百分率比較

BPD組生后7 d、14 d ILC2百分率均高于非BPD組（均P<0.001），兩組生后1 d ILC2百分率比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2、圖1。

圖1 兩組患兒外周血ILC2（CD45+Lin-CRTH2+CD161+CD127+）流式細胞儀分析圖 A為流式細胞術檢測出生后不同時間ILC2的設門圖；B為出生后不同時間外周血中ILC2百分率。右下象限區域即為ILC2所在區域，BPD組生后7 d、14 d ILC2百分率均高于非BPD組。

表2 兩組外周血PBMC中ILC2百分率比較 （± s，%）

表2 兩組外周血PBMC中ILC2百分率比較 （± s，%）

注：［BPD］支氣管肺發育不良。

images/BZ_78_1320_2765_1494_2883.pngimages/BZ_78_1494_2765_1579_2883.pngimages/BZ_78_1579_2765_1812_2883.pngimages/BZ_78_1812_2765_2046_2883.png組別非BPD組BPD組例數30 46生后1 d 0.401±0.398 0.401±0.384生后7 d 0.641±0.414 0.741±0.455生后14 d 0.819±0.478 0.935±0.421-10.770<0.001

2.3 兩組外周血IL-33、TSLP、IL-25、IL-5和IL-13水平比較

BPD組外周血IL-33、TSLP和IL-5水平在生后7 d和14 d時均高于非BPD組（均P<0.05），在生后1 d時與非BPD組比較差異無統計學意義（P>0.05）。出生后各時間點兩組IL-25和IL-13水平比較差異均無統計學意義（均P>0.05）。見表3。

表3 （續）

表3 兩組患兒生后不同時間外周血IL-33、IL-25、TSLP、IL-5及IL-13水平比較 （xˉ± s，pg/mL）

2.4 外周血IL-33、TSLP和IL-5與BPD發生的多因素logistic回歸分析

以BPD是否發生（發生BPD為1，不發生為0）為因變量，以胎齡、出生體重、IL-33、TSLP和IL-5為自變量，進行多因素logistic回歸分析。結果顯示，校正胎齡和出生體重后，生后7 d和14 d升高的IL-33、TSLP和IL-5與BPD發生密切相關（均P<0.05）。見表4。

表4 生后7 d及14 d早產兒發生BPD的多因素logistic回歸分析結果

2.5 外周血ILC2、IL-33、TSLP和IL-5的ROC曲線分析

分別以生后7 d和14 d外周血IL-33、TSLP、ILC2和IL-5水平為檢驗變量，以患兒是否患有BPD為分類變量繪制ROC曲線，結果顯示IL-33、TSLP、IL-5和ILC2的AUC均大于0.7（均P<0.05），見表5。

表5 外周血ILC2、IL-33、TSLP和IL-5對BPD的診斷價值

3 討論

BPD的高危因素包括早產兒、低出生體重、長時間氧療等，住院期間并發的肺部感染、肺水腫等也是導致BPD發生、發展的重要原因［2］。本研究觀察了76例胎齡<32周且住院時間≥14 d的早產兒，其中30例發生BPD，BPD發生率為39%，發生率與既往研究［3］相符。與非BPD組相比，BPD組患兒出生體重和胎齡較非BPD組明顯降低，而性別、出生方式、生后使用肺表面活性物質、母親產前使用類固醇激素差異均無統計學意義，與既往研究［19］結果一致，進一步說明胎齡和出生體重是BPD發生的重要因素。

新生兒特別是早產兒，適應性免疫尚未發育成熟，先天性免疫在這一時期發揮重要作用。ILC2是近年發現的重要先天免疫細胞，廣泛分布于機體各組織器官中，其中肺黏膜組織中數量最多。研究發現，ILC2在早期肺發育過程中可能是必需的［20］。本研究顯示，外周血ILC2百分率在兩組均呈現為生后1 d時很低，以后逐漸增加的趨勢，適量增加的ILC2可能有助于肺泡化建立；與非BPD組相比，BPD組ILC2在生后7 d和14 d明顯升高。研究發現，BPD小鼠ILC2較正常對照組明顯增加，減少BPD小鼠ILC2數量，其肺損傷和肺部炎癥改善［13］，提示ILC2促進了BPD病理過程。

ILC2上游細胞因子IL-25、TSLP、IL-33可促進ILC2擴增并產生Th2細胞因子發揮免疫調控作用［21］。與非BPD組相比，BPD組IL-25水平在各時間點差異均無統計學意義，而TSLP和IL-33在生后7 d和14 d明顯高于非BPD組，與ILC2的升高趨勢一致，推測在BPD形成過程中，ILC2的活化可能主要與TSLP和IL-33升高有關，IL-25對ILC2的活化作用可能不大。

IL-33是AECⅡ分泌的一種警報素，屬于IL-1細胞因子家族，可驅動2型免疫反應［22］。新生小鼠高氧暴露后，肺IL-33和ILC2增加，誘發氣道炎癥反應［23］，升高的IL-33還可導致異常肺泡化和持續的肺重塑，使新生兒肺部發育受阻，導致BPD發生。這一點在小鼠BPD模型中也得到了相應證實［24-25］，發現BPD組肺組織中IL-33水平明顯升高；而抑制IL-33可以通過減少炎癥介質的釋放從而減輕肺損傷。本研究BPD組IL-33較非BPD組明顯升高，結合以上研究，推測IL-33與BPD的發生發展密切相關。

TSLP在呼吸道疾病如支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病中異常表達［26-27］，促進ILC2分化，驅動呼吸道Th2免疫反應，導致氣道炎癥和氣道重塑。TSLP受體缺陷小鼠氣道炎癥顯著減少［28］。本研究顯示，與非BPD組相比，BPD組患兒外周血TSLP升高，推測TSLP也可能參與了BPD氣道炎癥的發生發展。

研究表明，ILC2 也可以分泌 IL-5 和IL-13［4］。與非BPD組相比，BPD組IL-13水平在各時間點差異無統計學意義，而IL-5在生后7 d和14 d明顯高于非BPD組，與ILC2的升高趨勢一致，推測在BPD形成過程中，ILC2主要產生IL-5，而對IL-13的激活作用可能不大。研究表明，IL-5可影響肺局部微環境，導致炎癥性免疫反應發生［29］。阻斷IL-5可顯著改善新生小鼠肺部炎癥，同時保護了肺泡的完整性［30］。推測IL-5可能參與了BPD氣道炎癥反應。

本研究多因素logistic回歸分析顯示，在校正胎齡和出生體重后，IL-33、TSLP和IL-5與BPD發生密切相關，且ROC曲線結果提示，ILC2、IL-33、TSLP和IL-5對BPD有較高預測價值，提示ILC2、IL-33、TSLP及IL-5水平升高可預警BPD的發生。已有研究探討早產兒BPD早期風險預測模型，發現生后7 d、14 d預測模型可有效預測BPD的發生［1］，與本研究時間點選擇一致。

綜上所述，ILC2、IL-33、TSLP及IL-5可能參與了BPD的發生發展，且其水平升高可預警BPD的發生。本研究局限性包括：由于樣本量少，未分析不同嚴重程度BPD早產兒基線資料和外周血ILC2及相關因子水平的差異，研究結果可能存在偏倚；檢測肺泡灌洗液中相關指標可更直接反映肺部炎癥改變，但由于倫理問題，肺泡灌洗液獲取困難。未來可進一步擴大樣本量，同時結合動物實驗對ILC2及相關因子的作用進行深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明無利益沖突。