嵌合抗原受體T細胞在兒童復發難治性急性淋巴細胞白血病中的研究進展

韋楠 綜述 陳天平 劉洪軍 審校

（安徽省兒童醫院血液科，安徽合肥 230051）

急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是兒童期最常見的惡性腫瘤，隨著聯合化療和精準分層治療的開展，兒童ALL的5年總生存（overall survival，OS）率明顯提高，但仍有近20%的ALL患者因化療耐藥而出現復發［1］。復發難治性ALL患兒的預后不容樂觀，5年OS率僅為19%~52%［2］。傳統的異基因造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT） 是ALL治療的重要手段，但復發難治性患兒在移植前難以達到緩解狀態，即使緩解后接受HSCT，患者的遠期復發率仍高達20%~30%［3-4］。免疫治療是近年來腫瘤治療領域的重大突破，其中嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法發展最為迅速［5］。目前瑞士諾華制藥有限公司研發的靶向白細胞分化抗原19（cluster of differentiation 19， CD19） CAR-T 細 胞 產 品Tisagenlecleucel（商品名：Kymriah）已經美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）審批上市，但國內尚無針對兒童ALL的CAR-T細胞產品獲批。本文就CAR-T細胞在兒童復發難治性ALL中的研究進展作一綜述。

1 CAR-T細胞的結構概述

CAR-T細胞主要包括3個功能結構域，即細胞外結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。細胞內結構域由共刺激結構域和信號轉導結構域組成，其中共刺激結構域通常為白細胞分化抗原28（cluster of differentiation 28，CD28）或腫瘤壞死因子受體超家族成員9（recombinant tumor necrosis factor receptor superfamily，member 9，TNFRSF9），信號轉導結構域由T細胞受體 （T cell receptor，TCR）/CD3ζ鏈構成［6-7］。根據細胞內結構域可將CAR-T細胞分為5代，截至2022年，FDA批準上市的6款CAR-T產品均為第二代CAR-T細胞。第三代CAR-T細胞包含2個或更多的刺激分子，在此基礎上引入自殺基因或免疫調控元件的CAR-T細胞，即重定向用于通用細胞因子介導殺傷的T細胞（T-cells redirected for universal cytokine killing，TRUCKs），它的提出意味著第4代CAR-T細胞的誕生。第5代CAR-T細胞插入了白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）受體鏈和共刺激結構域，并通過激活蛋白酪氨酸激酶JAK（janus kinase）-信號轉導子及轉錄激活因子（signal transducer and activatior of transcriptor，STAT）途徑促進細胞因子信號傳遞［8］。盡管在抗腫瘤能力和安全性方面還未得到臨床試驗的證實，但新一代CAR-T細胞仍有望在血液腫瘤以外開辟新的治療領域，取得更多革命性進展。

2 CAR-T細胞免疫治療兒童復發難治性ALL的優勢

2013年，Grupp等［9］教授團隊在New England Journal of Medicine雜志上發表了2例復發難治性ALL患兒接受CD19 CAR-T細胞免疫治療，其中1例患兒在治療后約2個月復發，免疫分型檢測表明其白血病細胞表面CD19抗原表達轉陰；而另1例患兒接受治療后約1個月實現白血病形態學及分子生物學的完全緩解（complete remission，CR），現已無病生存10年，成為首位受益于CAR-T細胞免疫治療的ALL患者。隨著Tisagenlecleucel的審批上市，全球首個兒科CAR-T細胞免疫療法Ⅱ期注冊試驗ELIANA在全球25個醫學中心開展，共75名兒童和年輕成人患者入組接受了Tisagenlecleucel治療，3個月內的總體緩解率（overall response rate，ORR）為81%，且微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）均為陰性［10］。6個月的無事件生存（event-free survival，EFS）率和OS率分別為73%（95%CI： 60%~82%） 和 90% （95%CI： 81%~95%），隨訪12個月EFS率和OS率分別為50%（95%CI： 35%~64%） 和 76% （95%CI： 63%~86%），所有患者均未出現治療相關死亡。Tan等［11］對12例合并中樞神經系統白血病（central nervous system leukemia，CNSL）的急性B淋巴細胞白血病（B cell-acute lymphoblastic leukemia，BALL）患兒予以CD19 CAR-T細胞治療，9例患兒獲得緩解，6個月無白血病生存（leukemia-free survival，LFS）率為81.8%（95%CI：59%~100%）。Chen等［12］報道了7例睪丸復發的ALL患兒接受CD19 CAR-T細胞免疫治療，所有患兒均達到CR，睪丸均恢復正常。隨訪12個月，所有患兒的EFS為83.3%±15.2%，表明CAR-T細胞免疫治療在髓外復發ALL患兒的治療中同樣發揮顯著效果。Stefanski等［13］對兒科真實世界CAR聯盟（Pediatric Real World CAR Consortium， PRWCC）成員機構的185例輸注Tisagenlecleucel的患者數據進行回顧性分析，輸注CAR-T細胞的中位劑量為1.7×106細胞/kg，其中86例患者接受了更高劑量（1.701~5.100×106細胞/kg） 的CAR-T細胞輸注，結果接受更高劑量Tisagenlecleucel患者的OS、EFS和RFS均得到明顯改善（P=0.031，0.0079和0.0045），且更高劑量的Tisagenlecleucel與毒性增加無關。ZUMA-4是應用靶向CD19的CAR-T細胞產品KTE-X19（商品名：Tecartus）治療兒童/青少年復發難治性B-ALL的Ⅱ期臨床研究，在可評估劑量限制性毒性的患者中并未觀察到劑量限制性毒性，而劑型為1×106CAR-T細胞/kg（40 mL）隊列中，患者的CR率及CR伴不完全血液學恢復（CR with incomplete count recovery，CRi） 率可達71%，MRD陰性率達100%［14］。另一項來自美國的單中心Ⅰ期劑量遞增研究［15］中，50例兒童和年輕B-ALL患者接受了CD19.28ζ-CART細胞治療，31例（62.0%）獲得CR，中位隨訪時間為4.8年，中位OS為10.5個月（95%CI：6.3~29.2個月）。在MRD陰性的28例患者中，有21例在CAR-T細胞輸注后橋接了HSCT，其中位OS為70.2個月（95%CI：10.4個月至無法評估），表明CD19.28ζ-CAR T細胞橋接HSCT序貫治療能使相當一部分兒童和年輕B-ALL患者獲得疾病的持續緩解。

學術界仍在探索影響CAR-T細胞治療反應性和持久性的相關因素。在一項多中心的回顧性研究［16］中發現，相比處于緩解狀態或者腫瘤負荷較低的患者，高腫瘤負荷患者（輸注前骨髓原始細胞超過5%、合并CNSL以及髓外病灶）在輸注CAR-T細胞后的OS和EFS明顯降低（P<0.001）。Zhang等［17］對254例應用CD19 CAR-T細胞治療的B-ALL患者的隨訪結果進行分析，發現TP53（tumor protein P53）突變和骨髓原始細胞>20%是影響患者CR率的兩個獨立危險因素，而年齡、髓外疾病、復雜的細胞遺傳學、既往移植史、既往化療療程、CAR-T細胞劑量和細胞產品的制造來源并不影響患者的CR率。與未接受CAR-T治療的患者相比，在HSCT前接受CAR-T治療患者的OS和LFS更高。

3 CAR-T細胞治療兒童復發難治性ALL的不良反應

3.1 細胞因子釋放綜合征

細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS）是CAR-T細胞輸注后最常見的不良反應，主要機制是淋巴細胞活化導致的大量細胞因子釋放［18］。與CRS最為密切的細胞因子包括白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、白細胞介素1（interleukin 1，IL-1）、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1和血管內皮生長因子A［19］。Maude等［20］對137例接受Tisagenlecleucel治療的難治復發性B-ALL患者的不良事件進行總結，結果發現77%的患者出現3~4級Tisagenlecleucel相關不良事件，在輸注后8周內最常見的不良事件為CRS，其中22%患者為4級CRS。除了糖皮質激素以外，以IL-6為靶點的抗細胞因子治療可顯著縮短CRS病程，且不影響CAR-T細胞作用和遠期療效。托珠單抗和司妥昔單抗是兩種常用的抗IL-6生物制劑，Zhang等［21］研究顯示IL-6水平升高不到4倍的患者在接受托珠單抗治療后發生嚴重CRS的概率更高（P=0.0125），這為在IL-6指導下細化CRS干預策略提供了依據。

3.2 免疫效應細胞相關神經毒性綜合征

免疫效應細胞相關神經毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）是CAR-T細胞治療過程中的另一種嚴重不良反應，發生率為20%~70%，可與CRS同時出現，也可在CRS改善后出現，其發生率隨CRS嚴重程度的增加而增加 （P<0.001）［20］。目前ICANS的發病機制尚不明確，大量炎性因子釋放可能是ICANS的始動環節，血清中炎性因子水平異常升高可直接損傷血管內皮細胞并活化星形膠質細胞和小膠質細胞，引起血腦屏障通透性異常改變［22］。在一項前瞻性隊列研究［23］中，3例骨髓復發且合并活動性神經系統癥狀的患兒在輸注CD19 CAR-T細胞后，1例出現5級ICANS，表明高腫瘤負荷可能會增加嚴重神經毒性的風險。神經絲輕鏈（neurofilament light chain，NfL）作為神經軸突損傷的標志物，其血清水平與ICANS的嚴重程度呈正相關，可作為預測ICANS發生及評估ICANS嚴重程度的生物學指標［24］。ICANS的治療方案類似于CRS，主要是在基于毒性等級評估的基礎上予以積極的支持治療。IL-1受體拮抗劑阿那白滯素（Anakinra）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子抑制劑Lenzilumab（侖茲魯單抗）在ICANS動物模型中顯示出一定的治療效果，未來有望在ICANS的治療中發揮作用［25］。

3.3 B細胞缺陷

由于CAR-T細胞在靶向殺傷腫瘤細胞的同時清除表達CD19、白細胞分化抗原22（cluster of differentiation 22，CD22）等正常B細胞。B細胞缺陷持續時間從2個月到2年，其持續時間長短可作為衡量CAR-T細胞持久性的重要指標。在一項國際、多中心、回顧性隊列研究［26］中，35例B-ALL患者接受了Tisagenlecleucel輸注，隨訪12個月，B細胞免疫缺陷的發生率約為70%（95%CI：46%~84%）。CAR-T細胞輸注后的患者應定期檢測B細胞數目和免疫球蛋白水平，對于嚴重或復發性細菌感染的患者，應優先考慮每月一次免疫球蛋白輸注［27］。

3.4 血液學毒性和其他并發癥

在輸注CAR-T細胞前采取的常規清除淋巴細胞預處理方案，以及CAR-T細胞輸注后的脫靶效應是導致血液學毒性的主要原因。目前文獻報道的CD19 CAR-T細胞治療B-ALL后3~4級中性粒細胞減少發生率為53%~94%，3~4級貧血的發生率為51%~68%，3~4級血小板減少的發生率為41%~53%［28-31］。感染也是CAR-T細胞治療的重要并發癥，在CAR-T細胞輸注后28 d內發生的感染定義為早期感染。在Hill等［32］的報道中，早期感染發生率約23%左右，且CRS的嚴重程度與感染密切相關。盡管超過半數患者為細菌感染，但中國人口基數大，乙型肝炎病毒攜帶率高，如何控制乙肝病毒激活的風險仍然需要引起重視。對于CART細胞輸注前腫瘤負荷高的患者而言，輸注后出現腫瘤溶解綜合征的風險更大，且比化療引起的腫瘤溶解綜合征更加嚴重。凝血功能異常與內皮細胞的異常激活或損傷有關，但出現嚴重臟器出血導致死亡者罕見［33］。嗜血細胞性淋巴組織細胞增生癥/巨噬細胞活化綜合征（hemophagocytic lymphohistiocytosis/macrophage activation syndrome，HLH/MAS）常繼發于重度CRS，在臨床癥狀方面也存在一定的重疊，目前報道其發生率低于1%，但死亡率極高。此外，CAR-T細胞輸注后的移植物抗宿主病、皮膚損害等也有少量報道。今后仍需要大量研究以精確管理及控制CAR-T細胞治療相關并發癥，對提高患者預后及生存質量具有重要意義。

4 CAR-T細胞治療后的復發

越來越多的研究［34］表明，CAR-T細胞治療后的患者并不能獲得長期緩解，近50%的患兒在1年內出現復發。根據CD19抗原是否存在可分為CD19陽性復發和CD19陰性復發。CD19陽性復發的主要原因是CAR-T細胞的持久性差，在這種情況下，CD19抗原仍然保留在腫瘤細胞表面。但在CD19陰性復發的情況下，CD19抗原將不再存在，腫瘤將不能被CAR-T細胞識別和清除，稱為抗原逃逸［35］。但仍有一些患者的復發不一定表現為抗原完全喪失，提示存在其他潛在機制導致腫瘤逃避CAR-T細胞的攻擊，如抗原密度降低、抗原編碼基因突變、選擇性剪接、譜系轉換等［36-38］。此外，腫瘤抑制微環境中的各種代謝物、抑制性細胞因子、免疫抑制細胞也會影響CAR-T細胞的活性［39-40］。CAR-T細胞上的某些抑制分子如程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）、T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白 3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，TIM-3）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyteassociated protein 4，CTLA-4）及淋巴細胞活化基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）等的上調也會導致T細胞功能抑制和衰竭［41-42］。

5 減少復發和提高CAR-T細胞療效的策略

隨著CAR-T細胞適應證的不斷增加，學術界開始將研究重點轉向如何減少復發和提高CAR-T細胞的療效，針對CAR-T治療的全過程采取多種綜合措施有望降低復發率。首先需要建立T細胞供者篩選和采集后評價體系，并不斷完善標準化的CAR-T細胞制備生產流程以及質量檢驗控制標準。其次可以通過研發人源化CAR-T細胞、通用型CAR-T細胞、改進基因編輯技術、優化預處理方案等增強CAR-T細胞的功能并延長其生存時間［43-44］。為了進一步減少輸注后腫瘤細胞的免疫逃逸，有學者提出開發可作用于多個抗原靶點的CAR構建物。目前報道的臨床前數據包括抗CD19和抗CD22靶向CAR-T、抗CD19和抗白細胞介素-3受體 α鏈（interleukin-3 receptor alpha chain，IL-3 Rα）組合CAR-T等。在CAR-T細胞治療同時聯合新藥如B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抑制劑、布魯頓酪氨酸激酶（Bruton” s tyrosine kinase，BTK）抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI） 等可顯著增強CAR-T細胞的抗腫瘤效應，但其具體機制及適應證仍需要大量研究進一步明確［48-49］。

6 總結及展望

目前CAR-T細胞在兒童復發難治性ALL的治療中顯示出良好前景，尤其是對于合并CNSL以及睪丸等髓外病灶的患者揭示了新的治療策略，但機遇與挑戰并存，在免疫治療的新時代，仍需要不斷改進CAR-T細胞的結構設計、制備工藝、質量控制標準以提高CAR-T細胞的有效性和安全性，而對于CAR-T細胞在體內的生物學特性以及腫瘤免疫逃避的機制，也還需要大量研究數據進行探討。我們有理由相信，隨著對CAR-T細胞研究的不斷深入，制約其臨床大規模應用和推廣的因素必將逐漸消失，CAR-T細胞將成為一種更加安全有效的細胞免疫療法，也必然會改變現有的治療模式，造福更多復發難治性ALL患兒。