傳統富源酸菜中優質乳酸菌的篩選及應用

黃慧福，寧丹，楊誠睿

（1.曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南 曲靖 655011；2.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118）

傳統酸菜是生鮮菜上固有微生物在一定條件下發酵產生乳酸及各種風味物質而成[1-2]。乳酸菌群在酸菜的發酵體系中發揮主導作用[3]，其發酵產生的酸、醇、酯等呈味物質，賦予了酸菜特有的風味及口感[4]；乳酸菌代謝產生的乳酸和細菌素等物質可以抑制發酵體系中腐敗菌的生長[5]；酸菜中的乳酸菌及其代謝物還具有助消化、調節腸道菌群、降血脂等生理功效[6-7]；酸菜中的乳酸菌還可以降解亞硝酸鹽[8]。但是自然發酵的酸菜，因為參與作用的微生物種類多，缺少性能優良的專用乳酸菌酸菜發酵劑，產品易出現不穩定、腐爛率高、亞硝酸鹽含量偏高等問題[9-11]。

富源酸菜是云南省富源縣境內特有的一種酸菜，以蘿卜或小油菜為主要原料，添加玉米面和飲用水，經發酵而成的具有地方風味的水酸菜，其加工方式與其他地方的酸菜有所不同，產品具有發酵周期短、酸絲長、黏稠滑膩和酸度高等特點，可直接食用或作為酸菜豬腳、紅豆酸湯的配料，備受當地人喜愛，2016年被列入曲靖市非物質文化遺產名錄[12]。目前富源酸菜生產仍以自然發酵為主，也同樣存在自然發酵酸菜共性的問題，嚴重制約了富源酸菜推廣和標準化生產。相關研究顯示，直投式乳酸菌發酵的富源酸菜可以在一定程度上解決以上問題[13]，但是不同區域的不同菌種和菌株發酵特性存在顯著差異[14-15]，而乳酸菌性能決定了酸菜的品質，尤其在酸菜發酵中產酸、耐酸耐鹽和降解亞硝酸鹽的能力[16]，所以選擇適合的富源酸菜發酵菌種很關鍵。因此，從傳統自然發酵富源酸菜中篩選本土優質的乳酸菌菌種，既能保證富源酸菜特殊的風味，又能提升富源酸菜的質量安全和推動其標準化生產。

本研究通過對云南富源縣境自然發酵酸菜發酵液進行乳酸菌分離、純化、發酵性能試驗及鑒定，以期獲得適合于富源酸菜標準化生產的菌種，為實現富源酸菜高品質規模化生產提供菌種資源和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌源：云南富源縣竹園鎮及老廠鎮自然發酵的紅蘿卜絲黏酸菜、白蘿卜絲黏酸菜、小油菜黏酸菜。

MRS液體培養基:北京奧博星生物技術有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、Qiagen凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑和引物：上海生工生物工程股份有限公司；氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈣（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

TU1900紫外可見分光光度儀：北京普析通用儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；ME103電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UPT-I-20T超純水機：上海優普實業有限公司；TH2-C恒溫搖床：太倉市實驗設備廠；3730XL測序儀、2720 thermal cycler PCR儀:美國Applied Biosystems公司；DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩壓電泳儀：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司；5415D高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

參考羅強等[17]的方法，采集樣品6份：選擇發酵品質良好的酸菜，將壇中蘿卜絲或小油菜與汁液充分混勻后，用無菌移液槍將汁液轉移至滅菌瓶中，低溫保存備用。

1.3.1 菌株分離及形態鑒定

參照王鑫宇[18]的方法，采用稀釋涂布平板法，取1mL酸菜汁用0.85%無菌生理鹽水梯度稀釋10-1～10-6制備系列濃度的酸菜汁，混合均勻。依次選擇10-3～10-6的稀釋樣品，分別取1 mL用涂布器涂布于MRS-CaCO3固體培養基，在38℃無氧條件下恒溫培養箱中培養48 h～72 h，從MRS-CaCO3固體培養基上挑出有明顯溶鈣圈的單菌落，再經過3次劃線分離培養；用革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗法，將分離后無雜菌的菌株涂布于MRS固體培養基上，在38℃無氧條件下恒溫培養箱中培養24h～36 h，觀察長出的單菌落形態，挑取單菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的細菌在顯微鏡下觀察其菌株形態特征并記錄。得到的菌株經過3次劃線分離，直到菌落鏡檢無雜菌，用MRS液體培養基進行傳代培養。同時接種在MRS斜面培養基上于4℃冰箱保存菌種備用。

1.3.2 菌株發酵性能測定

1.3.2.1 乳酸菌產酸速度和產酸量的測定

將傳代培養后的乳酸菌在MRS液態培養基中活化至109CFU/mL，以0.2%的接種量轉接到MRS液體培養基中，在38℃的恒溫培養箱中培養24 h，用pH計測量pH值，以空白MRS液體培養基作為對照。產酸量測定按照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》[19]。

1.3.2.2 乳酸菌降解亞硝酸鹽能力的測定

將活化的菌株按照2%的接種量接入5 mL的MRS液體培養基中，該培養基含有200 μg/mL亞硝酸鈉并且已滅菌，38℃培養24 h，參照國家標準GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中硝酸鹽與亞硝酸鹽的測定》[20]測定亞硝酸鈉含量。計算菌株的亞硝酸鹽降解率。

1.3.2.3 乳酸菌耐酸的生長測定

參照李小艷等[21]的方法，將MRS液體培養基pH值分別調為 2、3、4、5、6，將經過活化的菌株按照 2%的接種量接入上述的MRS液體培養基中，在38℃的恒溫培養箱中培養24 h，采用紫外分光光度計測定其在600 nm波長的吸光度（OD600）。

1.3.2.4 乳酸菌耐鹽的生長測定

將MRS液體培養基中分別添加NaCl，使其濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL，將經過活化的菌株按照2%的接種量接種上述的MRS液體培養基中，在38℃的恒溫培養箱中培養24 h，采用紫外分光光度計測定OD600值。

1.3.3 菌株分子生物學鑒定

參照丁馮玲等[22]的方法，采用16S rDNA序列同源相似性分析做菌種鑒定，測序引物序列如表1所示。

表1 測序引物序列Table 1 Sequence of the primer

1.3.4 優質菌株的應用

將篩選出來的優質菌株進行純種發酵試驗，并與自然發酵的富源酸菜進行比較。

富源酸菜純種發酵的工藝流程：蘿卜清洗、切絲→入缸→倒入玉米面、山泉水的混合物（已滅菌）→接入菌種→密封發酵→成品。

乳酸菌接種量為蘿卜質量的0.2%，在38℃接種，保溫發酵5 h后移至常溫發酵7 d。每天測定酸菜發酵液的總酸、pH值、亞硝酸鹽含量，并進行感官評價。請10位專業人員參照表2進行感官評分，理化檢測參考文獻[19-20]的方法。

表2 酸菜的感官評分標準Table 2 Standards of sensory evaluation of Fuyuan pickle

1.4 數據分析

所有試驗數據均重復進行3次，結果取平均值。用Excel 2010繪制圖表，用SPSS19.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

6份酸菜汁樣品中經過分離培養、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，菌落形態和生物學鑒定結果見表3。

表3 乳酸菌菌落形態及生物學鑒定Table 3 Colony morphology of the isolated strains and biological identification

根據《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[23]和《常見細菌系統鑒定手冊》[24]，6個樣品中均有4株菌落特征類似的菌株，經生物學初步鑒定均為乳酸菌。

2.2 菌株產酸速度和產酸量的測定

將N1、N2、N3、N4 4個菌株以2%接種量接種24 h后的pH值變化如圖1所示。

圖1 菌株接種24 h的pH值變化Fig.1 pH value of the liquid of the pickle fermented with different strains for 24 h

由圖1可知，菌株pH值均下降，空白對照的pH值為5.95，其中N1菌株pH值最小，為4.01，N3菌株pH值在4個菌株中最大，為5.03。說明N1菌株產酸速度快。

將N1、N2、N3、N4 4個菌株以2%接種量接種24 h后的產酸量如圖2所示。

圖2 接種24 h菌株的產酸量Fig.2 Acid production of strains inoculated for 24 h

由圖2可知，其中N1菌株產酸量最大，達到1.10%，N3菌株產酸量最小，為0.51%。說明N1菌株產酸速度快，產酸量高。

2.3 菌株降解亞硝酸鹽能力的測定

將N1、N2、N3、N44個菌株用含有亞硝酸鈉的MRS液體培養基培養24 h，降解亞硝酸效果如圖3所示。

圖3 菌株降解亞硝酸鹽的量Fig.3 Amount of nitrite degraded by strains

由圖3可知，不同種類的乳酸菌降解能力不一樣，其中N1菌株降解效果最好，可以將亞硝酸鹽含量降低到28.18 μg/mL，降解率為85.91%，降解率最大；N3菌株可以將亞硝酸鹽含量降低到31.27 μg/mL，降解率為84.37%，降解率最小。

2.4 菌株耐酸的生長測定

菌株接種24 h后的OD600值如圖4。

圖4 菌株耐受pH值的OD600值Fig.4 OD600of strains under different pH

由圖4可知，不同的菌株耐酸程度不同，所有菌株在pH2時OD600值最小，在pH5時OD600值最大。pH值低于3.0以下生長緩慢，其OD600值基本不變；pH值在3.0～5.0之間，菌株生長迅速；在pH值為5.0～6.0時，對菌株生長影響不大。總體菌株對強酸的耐受力不強，對弱酸的耐受力較強。N1菌株在pH3～6之間的MRS液體培養基中OD600值明顯高于其他菌株。

2.5 乳酸菌耐鹽的生長情況

菌株接種24 h后的OD600值如圖5。

圖5 菌株耐受氯化鈉的OD600值Fig.5 OD600of strains in the presence of NaCl at different concentration

由圖5可知，氯化鈉濃度低于0.04 mg/mL時，4個菌株的OD600值隨濃度變化很小，說明菌株均可在低于0.04 mg/mL氯化鈉溶液中很好地生長；當氯化鈉濃度大于0.04 mg/mL時，OD600值開始減小，之后呈上升趨勢。但在整個試驗中，4個菌株的耐鹽性不同，N1菌株生長受鹽濃度影響不大，其他3個菌株受鹽濃度的影響較為明顯。

2.6 16S rDNA序列分析

綜合以上發酵性能試驗結果，選取表現較為優異的N1菌種進行16S rDNA序列分析，結果見圖6。

圖6 N1的16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of PCR product of 16S rDNA of strain N1

由圖6可知，所制備的PCR產物條帶清晰，片段長為1493 bp，具有典型的16S rDNA特征，符合測序要求。

利用NCBI的BLAST軟件，將N1的16S rDNA與GenBank數據庫中的16S rDNA基因序列進行了比對，結果見表4。

表4 N1菌株的16S rDNA序列同源相似性分析Table 4 Homology of 16S rDNA sequence of strain N1

由表4可知，該菌株被鑒定為Lactobacillus（乳桿菌屬），Lactobacillus buchneri（布氏乳桿菌）。

2.7 優質菌株的應用

優質菌株純種發酵與自然發酵7 d內pH值、總酸、亞硝酸鹽的變化如圖7～圖9所示。

圖7 發酵7 d內pH值變化Fig.7 Change of pH value within 7 days of fermentation

圖8 發酵7 d內總酸含量變化Fig.8 Change of total acid content within 7 days of fermentation

圖9 發酵7 d內亞硝酸鹽含量變化Fig.9 Change of nitrite content within 7 days of fermentation

添加N1菌株的酸菜與自然發酵相比，顏色透亮，有光澤，有獨特的酸菜香味，香氣濃郁且純正，脆度高，質量均勻，產酸速度快、產酸量高，亞硝酸鹽含量低，亞硝酸鹽峰值提前，7 d內能使亞硝酸鹽達到安全的水平，比GB 2762—2022《食品安全國家標準食品中污染物限量》中關于醬腌菜的規定（20 mg/kg）低[25]。

3 結論

本研究從傳統自然發酵法制作的富源酸菜中分離純化后獲得4株乳酸菌；通過產酸、降解亞硝酸鹽、耐鹽、耐酸等發酵性能篩選，其中N1菌株性能最優。N1菌株經分子生物學16S rDNA鑒定為乳桿菌屬（Lactobacillus），布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）。將優異菌株N1應用于富源酸菜進行純種發酵，與自然發酵相比，感官評分更高、pH值更低、總酸含量更多、亞硝酸含量更少，并且亞硝酸峰值提前，說明篩選出的優異菌株N1能夠有效縮短發酵周期，并且提高富源水酸菜的質量和安全性，發酵特性優質。本研究結果可為傳統富源酸菜品質改良和優質菌種資源開發提供參考依據和技術支持。