魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

黃艷紅，張興榮，徐慧，國天慶，賀連智，田延軍

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東 濟南 250013）

魚露，又稱魚醬油、胰油，是一種傳統(tǒng)的東方食品[1]，主要以海洋低值魚類、淡水魚蝦或水產(chǎn)加工廢棄物為原料，在高鹽條件下經(jīng)過一兩年的發(fā)酵制成[2]，營養(yǎng)豐富、香氣濃郁、味道鮮美，被世界各地消費者廣泛接受。魚露的生產(chǎn)主要分布在東南亞如越南、泰國，我國東部沿海地帶，在歐洲和非洲地區(qū)也有分布[3-4]。進入二十世紀(jì)八十年代以來，魚露產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，目前國內(nèi)產(chǎn)量每年約10萬t以上[5]。魚露生產(chǎn)過程中，不可避免的產(chǎn)生魚頭、魚骨等大量發(fā)酵尾料，不加以利用會造成極大的資源浪費[6-7]，人口的增長，食物資源的短缺，也必然要求綜合利用魚體的價值[8-9]。魚露發(fā)酵尾料中含有大量的蛋白質(zhì)[10-11]，從魚露發(fā)酵尾料中提取蛋白質(zhì)、回收膠原蛋白，進行精加工，制備氨基酸強化劑、特殊風(fēng)味的魚味調(diào)味劑或開發(fā)具有生物活性的多肽，也是魚露生產(chǎn)行業(yè)新的經(jīng)濟增長點[12]。蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后得到水解蛋白，該類蛋白質(zhì)主要為低分子的多肽，含人體所需的必需氨基酸、牛磺酸、碘、硒以及B族維生素，水溶性好，營養(yǎng)豐富，具有增強免疫力和降低膽固醇等生理功效，極易被人體消化吸收[13-14]。蛋白酶的成本隨著酶技術(shù)的發(fā)展也在不斷降低，水解技術(shù)已經(jīng)成為制備水解蛋白較為有效的方法[15]，陳紫紅等[16]利用木瓜蛋白酶水解斑點叉尾鮰魚下腳料制備多肽，通過條件優(yōu)化得到水解液的水解度為38.89%，為斑點叉尾鮰魚附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的思路。王可琦等[17]以鰈魚加工過程中的下腳料為原料，通過中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進行復(fù)配，在最優(yōu)條件下水解度可達44.56%。水解技術(shù)的應(yīng)用可大大增加魚類資源的利用率，將該技術(shù)用于魚露發(fā)酵尾料中，開發(fā)其中的蛋白資源可以有效提高魚露發(fā)酵產(chǎn)品的附加值，目前鮮見該方面的報道。

本文以魚露的發(fā)酵尾料為原料，利用蛋白酶對其進行水解，通過單因素輪換法和響應(yīng)面分析法優(yōu)化其蛋白水解工藝，并對其水解產(chǎn)物抗氧化性進行研究，為后續(xù)魚露發(fā)酵尾料的綜合利用提供相應(yīng)的試驗依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烘干后的魚露發(fā)酵尾料：威海浦源食品有限公司。

中性蛋白酶（10萬 U/g）、木瓜蛋白酶（10萬 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（10萬 U/g）：安琪酵母股份有限公司；硫酸、鹽酸（分析純）：煙臺東明化工有限公司；甲醛（分析純）：天津天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、硼酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、石油醚（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；A004-96T羥基自由基清除能力測試試劑盒、96T氮自由基（DPPH）清除能力測試試劑盒：上海惠誠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KT8200凱氏定氮儀：福斯華（北京）科貿(mào)有限公司；pHS-3c型pH計、752型紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DZKW-A水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司；HFJ-10勻漿機：上海楚定分析儀器有限公司；LT53離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；JD200-3電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；Y921型料理機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定

總蛋白質(zhì)含量測定采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量測定

將原料置于勻漿機中，按照一定的料液比勻漿，調(diào)整體系pH值，水解、過濾、離心，之后去除上層油脂，得到清液，采用甲醛滴定法（GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》）測定清液中氨基酸態(tài)氮含量。按以下公式計算氨基酸態(tài)氮含量。

式中：X1為樣品中氨基酸態(tài)氮含量，g/100 g；V1為測定時加入甲醛后消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白加入甲醛后消耗的氫氧化鈉的體積mL；c為氫氧化鈉的濃度，mol/L；m 為樣品的質(zhì)量，g；V3為測定時上清液的用量，mL；V4為上清液的總體積，mL。

1.3.3 水解度的測定

水解度的計算參考寧詩文等[18]的方法。

1.3.4 單因素試驗

選取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種酶制劑，分別用緩沖溶液配制成相同濃度的酶溶液，對魚露發(fā)酵尾料進行單酶水解反應(yīng)，選取最佳酶制劑種類進行條件優(yōu)化。

在最佳酶制劑的基礎(chǔ)上采用單因素輪換法依次考察料液比 [1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）]、酶制劑用量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、水解時間（1、2、3、4、5、6、7、8 h）、pH 值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0）、水解溫度（25、30、35、40、45、50、55℃）。水解結(jié)束后，8 000 r/min離心 10 min，去除上層油脂，測量清液的體積，并取適量測定氨基酸態(tài)氮含量及水解度。

1.3.5 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗的取值范圍和最優(yōu)點，使用Design-expert 10.0軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，以水解度（Y）為響應(yīng)值，料液比（A）、酶制劑用量（B）、水解時間（C）為考察指標(biāo)，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法對水解條件進行優(yōu)化，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design

1.3.6 粗提物DPPH·和·OH清除能力的測定

水解液經(jīng)過離心、真空濃縮、冷凍干燥處理，得到水解蛋白粗提物。將粗提取配制成不同濃度的溶液（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL），參照 Jamdar等[19]和李敏等[20]的方法，按照DPPH·和·OH清除能力測試試劑盒的使用說明，采用分光光度法分別在517 nm和532 nm測定吸光度，按以下公式計算自由基清除率。

式中：A1為樣品組加入粗提物溶液和DPPH溶液時的吸光度；A2為空白組加入粗提物溶液，不加入DPPH溶液時的吸光度；A3為對照組不加粗提物溶液，加入DPPH溶液時的吸光度。

式中：A為樣品組加粗提物溶液測得的吸光度；A0為空白組用蒸餾水代替粗提物溶液測得的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin Pro2019軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，使用Design-Expert 10.0軟件進行響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)含量分析

以干燥后的魚露發(fā)酵尾料為原料，通過凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明，原料中蛋白質(zhì)含量為（35.12±0.55）%。魚類蛋白質(zhì)中氨基酸的組成與人體組成類似，具有較高的生理價值[21]，利用蛋白酶對魚露發(fā)酵尾料進行水解可以得到功能和品質(zhì)相對較高的水解蛋白。

2.2 不同蛋白酶對魚露發(fā)酵尾料水解效果的比較

以魚露發(fā)酵尾料為底物，選取4種不同反應(yīng)機理的蛋白酶進行水解，當(dāng)?shù)鞍酌概c發(fā)酵尾料中的蛋白質(zhì)作用時，因不同蛋白酶的作用條件不同，對蛋白質(zhì)水解度的影響也會不同。根據(jù)不同蛋白酶推薦的最適條件，按照相同的加酶量，對發(fā)酵尾料進行水解，結(jié)果見圖1。

圖1 酶種類對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.1 Effects of enzyme types on hydrolysis degree of fish sauce scraps

由圖1可知，4種蛋白酶的對魚露發(fā)酵尾料蛋白質(zhì)水解度的影響依次為堿性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。堿性蛋白酶的作用效果最好，對發(fā)酵尾料的水解度最高，因此選用堿性蛋白酶進行后續(xù)試驗。

2.3 堿性蛋白酶水解魚露發(fā)酵尾料的單因素試驗

2.3.1 料液比對水解度的影響

固定堿性蛋白酶的添加量為0.8%，水解溫度為40℃，水解時間為3 h，水解體系pH9.0，探討料液比對尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on hydrolysis degree of fish sauce scraps

不同的料液比代表不同的底物濃度，由圖2可知，隨著溶劑用量的增加，底物濃度的減小，水解度呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)料液比達到1∶10（g/mL）時，蛋白的水解度最高，為（25.80±0.55）%，之后水解度有下降趨勢。蛋白酶的酶促反應(yīng)存在著產(chǎn)物與底物的競爭性抑制，過高或過低的料液比，都會引起酶促反應(yīng)的失衡，導(dǎo)致原料中蛋白水解度的降低[22]。

2.3.2 酶用量對水解度的影響

在最佳料液比的基礎(chǔ)上，按照水解時間3 h、水解溫度40℃，水解體系pH9.0，探討不同加酶量對魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶用量對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of fish sauce scraps

由圖3可知，在加酶量低于1.0%時，隨著加酶量的增加，反應(yīng)底物在酶的作用下快速降解，水解度增加較快。在加酶量高于1.0%時，水解度稍有降低，此時酶的濃度過高，酶分子之間的競爭性抑制導(dǎo)致水解度的下降[15]。綜合考慮蛋白酶的成本等因素，選擇加酶量為1.0%。

2.3.3 水解時間對水解度的影響

在料液比1∶10（g/mL），加酶量為1.0%的基礎(chǔ)上，設(shè)置水解溫度為40℃，水解體系pH9.0，研究不同水解時間對尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 水解時間對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of fish sauce scraps

從圖4可以看出，水解前期（1 h～5 h）魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)的水解度隨著水解時間的延長快速增加，當(dāng)水解時間大于5 h時，水解度趨于平緩。原因在于隨著時間的延長，魚露發(fā)酵尾料中的蛋白逐漸較少，多肽被水解成氨基酸，體系中游離的氨基酸抑制了堿性蛋白酶的水解作用[23]，綜合考慮最適水解時間為5 h，此時蛋白質(zhì)的水解度為（36.59±0.53）%。

2.3.4 水解體系pH值對水解度的影響

在料液比1∶10（g/mL），加酶量為1.0%的基礎(chǔ)上，設(shè)置水解溫度為40℃，水解時間為5 h，研究不同水解體系pH值對尾料中蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 pH值對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.5 Effect of pH value on hydrolysis degree of fish sauce scraps

水解體系的pH值能夠pH能夠影響底物及酶的解離狀態(tài)、空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶與底物的結(jié)合以及酶的活性[24]。由圖5可知，隨著體系pH值的增加，發(fā)酵尾料中蛋白的水解度呈先增加后減少趨勢，在pH10.0左右水解度最大，為（37.89±0.61）%，水解效果最好，因此選擇水解體系的最佳pH值為10.0。

2.3.5 水解溫度對水解度的影響

在最佳料液比、加酶量、水解時間、水解體系pH值的基礎(chǔ)上，考察不同的水解溫度對魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 水解溫度對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on hydrolysis degree of fish sauce scraps

由圖6可知，隨著反應(yīng)體系溫度的增加，魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度呈先增加后降低的趨勢，溫度在45℃～55℃，體系的水解度相對較高，此時反應(yīng)體系的分子運動加速，酶活性增加[6]。隨著溫度的上升，堿性蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，變性失活，導(dǎo)致蛋白酶水解度降低，因此選擇50℃作為后續(xù)試驗的水解溫度。

2.4 魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken試驗設(shè)計原理，優(yōu)化魚露發(fā)酵尾料中水解蛋白的提取工藝，試驗設(shè)計與方差分析見表2、表3。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test results

采用Design-Expert 10.0軟件對表2的結(jié)果進行回歸性分析，以水解度（Y）為因變量，料液比（A）、堿性蛋白酶用量（B）、水解時間（C）為自變量，建立回歸方程：Y=40.84+2.34A+4.89B+5.35C-0.47AB-2.35AC+0.37BC-3.16A2+5.24B2-5.338C2。

由表3可知，模型的P＜0.05，影響顯著，失擬值P＞0.05，影響不顯著，說明該模型較為適合，試驗點均可用模型描述。此外，相關(guān)系數(shù)R2為0.986 8，表明該模型有較好的可信度，即該模型能夠很好地解釋料液比、堿性蛋白酶用量、水解時間對魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)水解度的影響。一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），AB、BC 對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)試驗結(jié)果建立響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖7。

圖7 各因素交互作用對魚露發(fā)酵尾料水解度的影響Fig.7 Response surface plots of effect of interaction between each factor on hydrolysis degree of fish sauce scraps

響應(yīng)面圖和等高線圖能夠直觀地反映不同因素之間的交互作用及其對響應(yīng)值（Y）的影響，由圖7可知，料液比（A）與水解時間（C）之間的交互作用對水解度（Y）的影響最大，其次是料液比（A）與堿性蛋白酶用量（B）的交互作用，堿性蛋白酶用量（B）與水解時間（C）的交互作用最小，與方差分析結(jié)果一致。

由模型預(yù)測的最優(yōu)條件為料液比1∶10（g/mL）、酶用量1.1%、水解時間5.4 h，在此優(yōu)化條件下水解度理論值為43.48%。為了驗證模型的有效性，在上述水解條件下進行驗證試驗，得到魚露發(fā)酵尾料中蛋白質(zhì)的水解度在（43.78±0.57）%，與理論值接近，說明方程與真實試驗情況擬合度較好，響應(yīng)面分析法得到的最佳工藝合理。

2.5 水解蛋白粗提物DPPH·和·OH清除能力試驗

水解蛋白粗提物的抗氧化活性與濃度的關(guān)系如圖8所示。

圖8 粗提物濃度對DPPH·和·OH清除能力的影響Fig.8 Effect of crude extract concentration on scavenging abilities of DPPH·and·OH

由圖8可知，粗提物濃度為1 mg/mL～10 mg/mL時，DPPH·和·OH清除率與粗提物的濃度均呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為10 mg/mL時，DPPH·清除率達到63.01%，·OH清除率為41.11%。隨著粗提物濃度的增加，暴露出的還原性基團的數(shù)量也在增加，其溶液的抗氧化活性也隨之增強。

3 結(jié)論

以魚露發(fā)酵尾料為研究對象，探討了不同蛋白酶對原料中蛋白質(zhì)水解度的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了魚露發(fā)酵尾料蛋白質(zhì)的制備工藝，得出最佳水解條件：料液比 1∶10（g/mL）、堿性蛋白酶用量1.1%、水解時間5.4 h、水解溫度50℃、pH10.0，在此工藝條件下，魚露發(fā)酵尾料中蛋白水解度為（43.78±0.57）%。同時DPPH·和·OH清除試驗分析發(fā)現(xiàn)，該水解蛋白粗提物具有較好的抗氧化活性。此研究可為魚露發(fā)酵尾料中水解蛋白的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考，有利于魚類的高值化利用及高附加值產(chǎn)品的開發(fā)。