響應面法優化天麻發酵液發酵工藝

陳剛，高晴，和勁松，羅艷霞，楊春蕾，盧文麗，錢瑞，付曉萍

（云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201）

天麻為蘭科植物，天麻的干燥塊莖又名赤箭、明天麻、定風草根等[1-3]，屬于多年生寄生草本植物，主要分布在云南省[1-4]。天麻具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡的功效，常用于頭痛、肢體麻木等癥狀的治療[5]。現代眾多藥理實驗及臨床應用表明，天麻具有鎮痛、鎮靜、抗驚厥的作用[5-8]，還能夠改善記憶、延緩衰老、增強免疫力等[9-11]。

馬克斯克魯維酵母代謝底物十分廣泛[12-13]，可代謝的底物包括葡萄糖、菊芋、糖蜜、乳清和木質纖維素等原料[12，14-16]。馬克斯克魯維酵母不僅具有生長迅速、耐熱性高、底物譜廣及能產多種酶等特點，而且具有較高的安全性[17-19]，2013年該酵母被中國國家衛生和計劃生育委員會批準為新食品原料。由于馬克斯克魯維酵母在生長特性及某些營養特性方面與釀酒酵母類似[20-21]，并且在耐熱性及底物范圍等方面更具優勢，其在食品工業領域具有廣泛的應用前景[17]。

目前天麻的食用方式傳統且單一，以中藥炮制方式處理鮮天麻居多。天麻屬于藥食同源植物，經微生物發酵可得到含有豐富活性物質及功效酶的發酵產物[22-24]，微生物通過自身的新陳代謝，使原料中各成分之間發生多種復雜反應，在產生新的活性物質和功效酶的基礎上還可以一定限度地保留原有營養物質[22，25-26]。本研究通過馬克斯克魯維酵母發酵鮮天麻，探索鮮天麻發酵的工藝條件，以期為天麻發酵液衍生產品的后續開發提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

烏天麻：產自云南省昭通市彝良縣小草壩，在4℃條件下貯藏備用；馬克斯克魯維酵母（ATCC 36534）：北京百歐博偉生物技術有限公司。

1.2 化學試劑

乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；氯化鈉、葡萄糖淀粉酶（酶活≥50 000 U/g）、普魯蘭酶（酶活≥100 000 U/g）、纖維素酶（酶活≥100 000 U/g）、葡萄糖（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；麥芽汁液體培養基：環凱微生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

EU-K1-20TQ超純水器：南京歐鎧環境科技有限公司；DJM膠體磨：上海東華高壓均質機廠；BSA124SCW電子天平：德國賽多利斯科學儀器有限公司；101HGZF電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LRH-250F生化培養箱：上海恒科學儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 馬克斯克魯維酵母發酵天麻工藝流程

鮮天麻前處理→過膠體磨→酶解→調配→高溫滅菌（85℃，15 min）→接種發酵→過濾→發酵液。

1.4.2 工藝操作要點

鮮天麻前處理：選取新鮮、飽滿、無霉斑、未發芽的天麻，洗凈表皮的泥土，晾干表面水分之后與蒸餾水以 1∶1（g/mL）料液比打漿 3 min。

過膠體磨：打漿后的天麻汁顆粒比較大，需要利用膠體磨進一步將大顆粒打磨細。將漿液過膠體磨3次，每次3 min。

酶解：基于天麻中淀粉含量較高，不利于微生物利用，因此選擇通過葡萄糖淀粉酶、普魯蘭酶、纖維素酶組成的復合酶（酶活比1∶1∶1）酶解天麻汁，酶解時間為180 min[27]。

調配：為獲得適合菌種發酵的pH值，采用碳酸氫鈉將天麻勻漿pH值調配至適合馬克斯克魯維酵母生長的條件。

高溫滅菌：將調配好的天麻勻漿置于85℃水浴條件下殺菌15 min，取出封口冷卻至室溫備用。

接種發酵：將低溫保藏的菌種于室溫融化，以1%接種量接種于麥芽汁液體培養基中活化增殖兩代，在無菌條件下將菌種濃度調整至7.30 lg（CFU/mL），隨后在無菌條件下，將固定濃度的馬克斯克魯維酵母種子液接種于滅菌完成并且冷卻至室溫的天麻勻漿液中，之后將其置于120 r/min、28℃的恒溫搖床中搖瓶發酵。待發酵完成即得天麻發酵液[20]。

1.4.3 發酵工藝單因素試驗

1.4.3.1 發酵時間的確定

固定初始pH值為6.0、裝瓶量100 mL（250 mL）、菌液濃度7.30 lg（CFU/mL）、菌種添加量1%和發酵溫度 28℃，于 120 r/min 的搖床中分別發酵 6、12、18、24、30、36、42 h，以馬克斯克魯維酵母的活菌數作為評價指標，選擇適宜的發酵時間。

1.4.3.2 菌種添加量的確定

固定初始pH值為6.0、裝瓶量100 mL（250 mL）、菌液濃度 7.30 lg（CFU/mL），分別添加 0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%的馬克斯克魯維酵母，于28℃、120 r/min的搖床中發酵36 h，以活菌數作為評價指標，選擇適宜的菌種添加量。

1.4.3.3 初始pH值的確定

固定菌液濃度7.30 lg（CFU/mL）、發酵溫度28℃、發酵時間36 h、裝瓶量100 mL（250 mL）和菌種添加量1.25%，改變初始 pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），以活菌數作為評價指標，選擇適宜的初始pH值。

1.4.4 響應面試驗設計

以單因素試驗為基礎，選取發酵時間、菌種添加量、初始pH值3個因素進行響應面試驗，以活菌數為響應值，采取Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項式方程進行顯著性分析，優化發酵工藝參數。Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.5 數據處理

在數據分析過程中，采用Excel 2010軟件對試驗數據進行整理，利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果進行分析，并使用Origin 2019進行制圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 發酵時間對活菌數的影響

發酵時間對活菌數的影響見圖1。

圖1 發酵時間對活菌數的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the viable count

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，馬克斯克魯維酵母的活菌數在18 h前增長較快，在18 h～36 h內增長減緩，36 h以后活菌數趨于穩定。說明馬克斯克魯維酵母發酵天麻勻漿期間，18 h前該菌處于對數生長期，之后逐漸生長減緩，到36 h以后處于穩定期。對數期的菌種繁殖速率較快，有利于縮短發酵周期。穩定期菌種數量最高，有利于收獲發酵產物[17，25]。因此，選擇發酵時間為30、36、42 h進行后續試驗。

2.1.2 菌種添加量對活菌數的影響

菌種添加量對活菌數的影響見圖2

圖2 菌種添加量對活菌數的影響Fig.2 Effect of inoculum amount on the viable count

由圖2可知，隨著菌種添加量的增加，天麻發酵液中活菌數呈現先上升后下降的趨勢，活菌數在馬克斯克魯維酵母的添加量為1.25%時達到最大值，之后隨著菌種添加量的提高活菌數迅速下降。造成此現象的原因可能是發酵液中營養物質含量一定時，當菌種添加量較少時，可供菌種代謝的營養物質相對充裕，菌種大量繁殖，伴隨著菌種添加量的增大，發酵液中可供菌種代謝的營養物質不再充足甚至不足以支撐菌種代謝完成時，菌種的生長可能受到影響[25]。因此，選擇菌種添加量為1.00%、1.25%、1.50%進行后續試驗。

2.1.3 初始pH值對活菌數的影響

初始pH值對活菌數的影響見圖3。

圖3 初始pH值對活菌數的影響Fig.3 Effect of initial pH value on the viable count

由圖3可知，活菌數在初始pH4.0～5.0之間隨初始pH值增大處于增長狀態，之后伴隨初始pH值的提高，活菌數開始下降，活菌數在初始pH值為5.0時達到最大，造成此現象的原因可能是發酵基質的初始pH值影響馬克斯克魯維酵母的生長、代謝及產物合成。初始pH值過低不利于菌株的生長，當初始pH值過高時，菌株的生長也會受到影響從而生長變緩，導致活菌數變少，代謝能力減弱。當初始pH值為5.0時，天麻發酵液中的馬克斯克魯維酵母活菌數最高，因此，選擇初始pH值為4.5、5.0、5.5進行后續試驗。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 響應面設計方案與結果

響應面設計方案及結果見表2。

表2 響應面設計與結果Table 2 Response surface design and results

2.2.2 建立回歸模型和方差分析

采用響應面軟件對表2進行統計分析后，得到活菌數的回歸方程：Y=8.45+0.31A-0.00749B-0.034C+0.12AB+0.020AC+0.027BC-0.18A2+0.068B2-0.14C2，對活菌數的回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

表3表明，活菌數的回歸模型顯著性結果顯示P＜0.01，為極顯著，表示擬合獲得的模型方程極顯著，說明試驗方法可靠，可用該模型對結果進行分析預測。失擬項P=0.304 5＞0.05，不顯著，模型校正系數R2=0.985 9，R2Adj=0.960 6，說明模型回歸擬合度和可信度均較好，試驗誤差小。活菌數的回歸模型中一次項A，交互項AB及二次項A2、C2對活菌數的影響極顯著（P＜0.01），其余項不顯著（P＞0.05）。此外，通過 F 值大小可以得到各因素對活菌數的影響順序為發酵時間（A）＞菌種添加量（C）＞初始pH 值（B）。

2.2.3 響應面因素交互分析

根據Design-Expert 8.0.6統計分析軟件獲得響應值的3D曲面圖，分析各交互作用對天麻發酵液中活菌數的影響，結果見圖4。

圖4 各因素交互作用對天麻發酵活菌數影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of the interactions of factors on the viable count in Gastrodia fermentation broth

由圖4可知，在探究發酵時間與初始pH值的交互作用時，當發酵時間一定時，發酵液中的活菌數伴隨著初始pH值的增大呈現先增加后減少的趨勢，響應面坡面變化陡峭，當初始pH值固定時，活菌數伴隨發酵時間的延長呈現先增加后減少的趨勢，坡面變化陡峭，且等高線呈橢圓形，表明發酵時間與初始pH值的交互作用顯著；發酵時間與菌種添加量的交互作用，以及初始pH值與菌種添加量的交互作用的曲面圖則較為平緩。上述結果與方差分析結果一致。

2.2.4 驗證試驗

通過回歸模型對馬克斯克魯維酵母發酵天麻的發酵工藝進行優化，得到最適發酵工藝為發酵時間42 h、菌種添加量1.26%、初始pH5.5，此條件下，天麻發酵液中活菌數預測值為8.764 lg（CFU/mL）。按照上述條件進行3次平行驗證試驗，得到發酵液中活菌數為8.7 lg（CFU/mL），實際值與預測值結果基本一致，說明該模型基本復合預測實際情況的要求。

3 結論

通過單因素和響應面法對馬克斯克魯維酵母發酵天麻的發酵工藝進行優化，得到優化后的發酵工藝為發酵時間42 h、菌種添加量1.26%、初始pH值為5.5，在此優化條件下，天麻發酵液中的活菌數為8.7 lg（CFU/mL），與預測值結果基本一致，實測結果與回歸模型的相對誤差為0.73%，表明響應面模型具備一定的可靠性，該模型可為天麻發酵工藝及其衍生產品的開發提供參考依據。