MALDI-TOF-MS鑒定銅綠假單胞菌“虛擬仿真實驗平臺”的設計與探索*

趙俊清，任艷茹，陳思含，馬冰杰，黃 剛，馬艷俠，楚 曼，△

1.陜西中醫藥大學醫學技術學院，陜西咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院檢驗科，陜西咸陽 712046

全自動快速生物質譜檢測系統簡稱質譜，在微生物鑒定領域具有廣泛應用，其打破了傳統微生物鑒定時煩瑣的流程，大大縮短了樣本的檢測時間，在靈敏度、分析速度和鑒定等方面也具有充分的優越性。但是，受儀器設備、經費、場地等多方面因素的限制，大多數高校檢驗學院/系無法配置與課程相關的所有實體儀器輔助教師理論教學，無法為學生提供“一對一”的實踐平臺。因此，不僅教師的教學質量會受到影響，學生分析解決問題和動手操作的能力也將大打折扣。

隨著計算機電子信息技術的成熟，虛擬仿真實驗可以用“平民化”的技術成本發揮虛擬儀器在教學中的重要作用，并且虛擬仿真儀器可以比實體儀器更好地呈現出儀器的內部結構和部件，幫助學生將抽象的內容具體化，更好地理解儀器的原理和操作[1]。虛擬仿真技術的成熟和普及，推動了虛擬仿真實驗在科學研究和實驗教學方面的廣泛應用，也促使教學和研究更加高效化。快速準確的微生物鑒定是臨床重要需求之一。由于微生物具有區別于其他種類的特殊蛋白質，因而擁有獨特的蛋白質指紋圖譜，質譜鑒定方法是目前最好的技術[2]。本文旨在通過對質譜原理、結構等的介紹，構建學習和考核于一體的沉浸式虛擬仿真實驗平臺。通過該平臺，學生可以更好地學習并掌握基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)的原理、結構、操作流程及結果判斷。

1 銅綠假單胞菌鑒定實驗

銅綠假單胞菌俗稱綠膿桿菌,是一種抗藥性強，致病率較低的非發酵革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然界中，主要存在于空氣、土壤及水體中[3]。飲用、食用及使用被銅綠假單胞菌污染的飲用水、食物或化妝品等,在抵抗力較差、長期使用廣譜抗菌藥物的人群中極易引發感染[4]。目前，經常使用生化鑒定法、培養法、聚合酶鏈反應等分子生物學方法對其進行檢測，現今，新發展起來的MALDI-TOF-MS,是通過對微生物蛋白質的分析來鑒定細菌，此方法適用于生物活性物質的大規模、高通量、快速篩選，目前，已經成為臨床快速診斷、環境質量監測和微生物研究的重要方法[5]。

1.1實驗的目的與原理 本實驗的目的是學習質譜鑒定銅綠假單胞菌的方法，掌握MALDI-TOF-MS的基本原理和操作方法，能夠熟練使用儀器并解決實驗中出現的問題，提高臨床實踐能力和動手能力。

本實驗的原理是將微生物樣本與基質溶液滴在樣品板上，溶劑揮發后，形成樣本與基質的結晶物質，基質從激光中吸收能量,使樣本吸附在極高的真空狀態下，基質與樣本之間發生電荷轉移使得樣本分子電離，形成離子束[6]。樣本離子束經高壓加速和聚焦后導入飛行時間質譜分析器，利用離子在電場和磁場中的運動性質，進行質量分析，檢測器收集不同質荷比的離子，并以質荷比為橫坐標，以離子相對強度為縱坐標形成特異性的蛋白質組指紋圖譜，然后與標準圖譜庫進行比對，得到鑒定結果[7]。見圖1。

1.2實驗流程 本實驗處理方法采用甲酸裂解法。甲酸裂解法是臨床應用較多的一種微生物處理方法，該方法是在菌落涂布后滴加60%～70%的甲酸溶液，待晾干后，再滴加基質溶液，這樣有助于細胞更好地裂解[8]。

圖1 銅綠假單胞菌鑒定實驗原理

1.3MALDI-TOF-MS鑒定銅綠假單胞菌實驗的不足 MALDI-TOF-MS價格高昂，學校無法批量購買，不能滿足學生親自操作的需求；大型貴重設備的操作需要具備一定的原理知識和操作經驗，否則容易造成設備的損壞；儀器較為精密，需要認真維護；質譜數據庫亟待完善。目前臨床使用的標準數據庫主要來自布魯克和梅里埃兩大廠家，其數據庫中的菌株大部分來自國際菌株，不能滿足國內本土化的微生物鑒定需要[9]。

2 虛擬仿真實驗設計

虛擬仿真實驗系統主要由實驗教學系統和實驗輔助教學平臺組成，其中實驗教學系統用來幫助學生學習完成實驗，可分為虛擬實驗平臺、虛擬場景、虛擬儀器功能、教學模式與考核模式介紹4個板塊；實驗輔助教學平臺是為了輔助學生更好理解實驗，主要有資料模塊、實驗模塊和問答模塊。

2.1實驗教學系統

2.1.1虛擬實驗平臺 學生可直接通過用戶登錄模塊登錄虛擬仿真實驗教學系統，輸入用戶名和密碼登錄并選擇相應實驗項目，便可得到實驗指導書，學生應在熟悉流程后進行實驗，完成并提交后，系統可在線批改并發布實驗成績[10]。

2.1.2虛擬場景 使用MALDI-TOF-MS儀器檢測臨床中的樣本主要包括3個步驟，分別是對樣本進行預處理，儀器檢測樣本，以及和數據庫對比得出結果[11]。本文的虛擬試驗就是通過實際實驗的操作步驟基于3D技術構建三維交互式的質譜儀虛擬仿真實驗系統。在建造場景的過程中要盡量保證虛擬場景與現實比例大致一致，以及考慮不同物體間放置距離是否合理，還原實際情況下實驗場景的布置，使學生可以沉浸式體驗實驗，體驗真實感[12]。

學生在進行實驗時，可以通過觀看仿真動畫來了解實驗的工作原理，包括基本結構(含透視化的內部構造)、開關機、校準和質控、鑒定、維護及軟件結果解讀和出報告等功能模塊。儀器基本結構，尤其是離子源(基質輔助激光電離源)和飛行時間質量分析器可360°觀看內外結構并配有詳細的解說文字，通過結構解說引出每部分結構的功能，進而通過3D動畫呈現出儀器原理，同時學生能夠在觀看學習視頻時,可以快進或快退,甚至對畫面效果也可進行改變，便于學生更好理解[13]。實驗構建了質譜儀、恒溫培養箱、移液器、培養皿、接種環等實驗所需的虛擬模型，學生通過鼠標點擊進行操作實驗的進一步執行，可以提高學生的實踐能力及邏輯思維能力。

2.1.3虛擬儀器功能 結合實驗需求選取需要實現儀器的主要功能：普通瓊脂培養基、1 μL接種環用于微生物的培養，MALDI-TOF MS用于微生物鑒定，二級生物安全柜用于保護工作人員和實驗環境，顯微鏡用于觀察微生物，微量移液器和槍頭用于定量轉移液體等。

2.1.4教學模式與考核模式 建立銅綠假單胞菌質譜鑒定的學習模式和考核模式。學習模式提供實驗規范操作步驟題型和操作要領提示，考核模式要求數據庫自動記錄操作者實際操作情況。在教學中學生通過中文字幕的提示及對實驗的了解進行操作，若學生完成當前界面所需的操作，系統則會自動進入下一界面；若學生操作過程中有忽略的步驟，系統將給予提示并計入后臺系統中。整個實驗完全結束后，系統將根據學生的操作表現及后臺所記錄的失誤進行評分。

2.2實驗輔助教學平臺

2.2.1資料模塊 主要包括了質譜儀的結構、原理、操作及注意事項、儀器的發展史、銅綠假單胞菌及考核小知識的資料，方便學生更好地了解實驗，完成實驗。

2.2.2實驗模塊 學生在此模塊進行實驗，完成后可查詢歷史實驗記錄及分值，了解進行實驗時的不足，以便下一次更好地完成。每一個步驟是否得分都可以查詢到。在實驗結束后，學生需要向系統提交一份實驗報告，包括實驗目的、實驗原理、儀器使用、實驗操作、實驗結果、討論與反思[14]。

2.2.3問答模塊 學生如果在實驗進行中或結束后，對某一操作或某一結果有疑問，可以在此發布，還可與其他學生交流探討，解答疑惑[15]。

3 虛擬仿真項目的實驗內容與步驟

3.1實驗內容 實驗內容包括標本前處理、儀器的使用及結果判定2大模塊，標本前處理部分主要包括標本采集和標本處理2個步驟，且標本處理需要經過細菌培養、溶液配制和菌株選擇3個過程；儀器的使用及結果判定部分包括學習實驗原理、儀器開關機、質控菌株校準、點樣檢測、電子圖庫對比鑒定、儀器的維護與保養。

3.2實驗步驟

3.2.1銅綠假單胞菌檢測的臨床適用范圍 虛擬實驗室以人機對話形式展示臨床就診過程及檢驗項目的選擇。

3.2.2培養前處理 以選擇題的形式從系統所給選項中選擇正確標本類型然后進入虛擬實驗操作界面選擇所需器材進行細菌的分離培養。

3.2.3微生物培養 在操作臺上選擇所需的器材，模擬真實接種步驟進行操作，尤其注意無菌操作及平板劃線法的正確操作方法，學生需正確完成平板劃線的接種步驟才能到達下一步驟的實驗操作，選擇恒溫培養箱溫度時需調節到銅綠假單胞菌最合適的生長溫度及正確的培養時間，無論選擇的溫度和時間是否正確都可以得出一個結果提示[16]。根據所選器材的正確性及操作過程得分。

3.2.4配制溶液 采用選擇題的形式選擇實驗所需溶液，按系統設定的溶液配制順序進入相應溶液配制界面進行操作。在操作臺上選擇所需溶液及器材，模擬真實配制溶液過程操作。注意每種溶液的量及比例。

3.2.5樣品處理及質控菌株校準 以選擇題的形式選擇所需器材及試劑，正確進行儀器的開機及點樣等操作。每個實驗步驟均預設指標，依據此指標系統自動判分。首先將標準菌株ATCC9027銅綠假單胞菌轉種至MH平板上37 ℃孵育過夜，每次檢查樣品前使用ATCC9027銅綠假單胞菌的特征峰校準飛行時間質譜。此步操作注意事項同銅綠假單胞菌的接種相同。點樣操作：(1)取出恒溫培養箱中培養好的樣本平板；(2)在操作臺上選擇一次性接種環和靶板，挑取單菌落少許菌體，在靶板的靶點內涂布成一個薄層；(3)點擊“下一步”，再次選擇所需儀器，采用微量移液管吸取1 μL的α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)溶液并在樣品點上覆蓋1 μL的HCCA溶液，與樣品混合；(4)點擊“晾干”按鈕并得到下一步提示，在室溫下自然晾干(約10 min)[17]。

3.2.6鑒定 點擊IN/OUT按鈕啟動MALDI板的裝載和彈出過程，將樣品靶板放入裝載端口關上蓋子，在計算機上設定合適的激光能量、質譜掃描范圍等參數，開啟質譜數據采集，通過軟件調控靶板位置從而選擇不同的測量位置。數據采集完成后，將經過自動處理質譜數據自動/手動傳入本地微生物指紋圖譜庫即微生物鑒定系統中鑒定結果。

3.2.7儀器檢測原理及臨床相關知識的學習與鞏固 學生完成實驗后自動彈出儀器原理和臨床疾病相關知識的視頻，如臨床表現、作用機制、其他實驗室檢查等，觀看之后彈出相應習題。

3.3考核方式與結果設定 實驗的考核選用“通關式”的過程性考核，學生在依次完成前一階段的所有作答后，即可進入下一作答環節，直至作答完畢[18]。實驗平臺設置學習模式和考核模式。學生只有通過學習模式的學習后方可進入考核模式。考核模式下，學生可根據系統提示，進行樣本采集、樣本處理、儀器操作等[19]。同時，回答題目過程中學生需根據自身知識儲備和實際操作等做出正確解答，回答正確即可進入下一實驗操作并獲得相應分數。

實驗結果由過程考核、題目回答和實驗報告體現。實驗結束，系統會根據學生實際操作給出各階段各主要操作步驟得分，以及答題分數。實驗完成，學生可獲得包括實驗原理、實驗操作、實驗結果等在內的實驗報告，以便鞏固自查。

4 小 結

MALDI-TOF-MS不僅在生物鑒定方面具有明顯的鑒定優勢，在醫學鑒定領域的應用也更加廣泛，在檢驗醫學中也發揮著尤為重要的作用。與此同時，考慮到數據庫中數據量的可能增加，在使用該技術的過程中需不斷更新參考數據庫，以期其檢測準確性和檢測性能的進一步提升[20]。因此，基于MALDI-TOF-MS構建的虛擬仿真實驗平臺，不僅對傳統教學有所助力，同時也能夠推進實驗教學的進一步優化。虛擬和實際的相結合，會在很大程度上提高學生的學習積極性，從而促進教學高質量化。另外，盡管建設虛擬仿真實驗平臺已成為教育教學中的一種實際需求，但在這個教育趨勢發展的同時，仍存在這樣或那樣的問題。雖然通過虛擬實驗確實可以在一定程度上解決實驗教學經費、場地等現實問題，但是虛擬仿真并不能完全代替實際操作的真實體驗。因此，教育教學還應以實際操作為主，輔以虛擬實驗。“虛擬仿真”能實不虛、虛實結合，實現虛擬仿真實驗的使用效果最大化。