碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性及多位點序列分型研究*

何秀娟，宋其華，田家辰，葉惠娟，王 紅，陳勝男

1.北京市昌平區(qū)醫(yī)院檢驗科，北京 102200;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟太卜寺旗旗醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古錫林郭勒 027000

鮑曼不動桿菌是我國醫(yī)院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一，但由于抗菌藥物，尤其是碳青霉烯類制劑的廣泛應用，碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌(CRAB)的檢出率和耐藥性在逐年上升。中國細菌耐藥監(jiān)測研究2017—2018年革蘭陰性菌監(jiān)測報告顯示，鮑曼不動桿菌對大多數(shù)被測抗菌藥物的耐藥率大于70%，其中對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率約70%，對多黏菌素E、替加環(huán)素和米諾環(huán)素的耐藥率低于30%[1]。本研究主要對CRAB進行藥物敏感性(以下簡稱藥敏)分析和同源性分析，以期為臨床治療和醫(yī)院內(nèi)感染控制提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集北京市昌平區(qū)醫(yī)院2017年1月至2019年12月從住院和門診患者分離的鮑曼不動桿菌200株，其中CRAB有47株，2017年12株，2018年19株，2019年16株，已剔除了同一患者的重復菌株。所有菌株采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行鑒定，確定為鮑曼不動桿菌。藥敏試驗的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和金黃色葡萄球菌ATCC29213。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗 采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)測定所有CRAB菌株對頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、妥布霉素、復方磺胺甲噁唑、氨芐西林/舒巴坦、替加環(huán)素、阿米卡星的最低抑菌濃度(MIC)。藥敏判斷參考美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2019的判斷標準[2]，其中替加環(huán)素參照美國食品和藥品管理局(FDA)判讀標準，MIC≤2 μg/mL為敏感，MIC≥8 μg/mL為耐藥。

1.2.2DNA提取 采用煮沸法來提取菌株DNA。取200 μL無菌水加入到無菌管內(nèi)，取適量新鮮菌落進行稀釋，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液存放在另一干凈無菌管中，獲得所需菌株DNA，在-20 ℃冰箱放置保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3多位點序列分型(MLST) 使用PCR擴增檢測鮑曼不動桿菌MLST的7個管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD[3]，引物序列見表1。

表1 鮑曼不動桿菌MLST分型引物序列和產(chǎn)物大小

所獲PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術有限公司進行測序。使用鮑曼不動桿菌基因數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/abaumannii/)對測序結(jié)果進行比對，可獲得各管家基因?qū)牡任换蚓幪枴Ｔ侔磄ltA-gyrB-gdhB-recA-cpn60-gpi-rpoD順序?qū)⒏骶旯芗一虻牡任换蚓幪栠M行排列組合，每個組合對應一個序列型(ST)，用此標識記錄每株菌株的分型。如果查找不到測序結(jié)果所對應的ST，經(jīng)核對后，確認為新的ST，相關數(shù)據(jù)上傳數(shù)據(jù)庫。最后應用eBURST 軟件對ST數(shù)據(jù)開展進化關系分析。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Whonet 5.6軟件統(tǒng)計分析耐藥率。

2 結(jié) 果

2.1菌株基本特征 47株CRAB標本類型以痰液(38株，80.9%)為主，其余為全血(4株，8.5%)、肺泡灌洗液(3株，6.4%)、分泌物(1株，2.1%)和腦脊液(1株，2.1%)。從男性患者中分離的菌株居多，分離自男性的有27株，占57.4%；分離自女性的有20株，占42.6%。從老年患者中分離的菌株居多，41株分離自≥65歲的患者，占87.2%；6株分離自38～<65歲的患者，占12.8%。2017—2019年檢出的鮑曼不動桿菌中CRAB占比逐年上升，由2017年的18.2%增加到2019年的28.1%，主要分布在內(nèi)科重癥監(jiān)護病房[66.0%(31/47)]、呼吸科[10.6%(5/47)]、重癥監(jiān)護病房[8.5%(4/47)]，不同年份CRAB占比及來源科室分布情況見表2。

表2 2017-2019年CRAB占比及來源科室分布情況

2.2藥敏試驗結(jié)果 檢出的CRAB對頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星完全耐藥，對氨芐西林/舒巴坦、慶大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、復方磺胺甲噁唑的耐藥率在50%以上，見表3。

表3 47株CRAB藥敏試驗結(jié)果(%)

2.3MLST分型結(jié)果 經(jīng)MLST分析獲得4種ST， 其中ST208和ST195為主要分型，分別占53.2%(25株)和40.4%(19株)，其次為ST369(4.3%，2株)和ST523(2.1%，1株)，未發(fā)現(xiàn)新的ST，ST位點信息見表4。eBURST分析得到一個同分型組，見圖1，發(fā)現(xiàn)這4種ST均屬于克隆復合體92(CC92)，對4種ST的管家基因進行對比，發(fā)現(xiàn)相差僅一個管家基因(gpi)或兩個管家基因(gltA、gpi)，ST208為各ST共同的祖先，其相互之間親緣關系很近。

表4 2017—2019年分離的CRAB標本ST位點信息

圖1 eBURST軟件分析結(jié)果圖

3 討 論

近年來，臨床上分離的重要耐藥細菌，尤其是以革蘭陰性桿菌為主的多重耐藥細菌的檢出率在快速上升，為臨床抗感染治療帶來了巨大的威脅和挑戰(zhàn)[4-5]。2017年世界衛(wèi)生組織(WHO)根據(jù)對新型抗菌藥物的迫切需求程度，發(fā)表了首份抗菌藥物耐藥“重點病原體”清單，其中CRAB被列為“極為重要”的新型抗菌藥物研發(fā)重點病原體之一，其對人類生命健康已構(gòu)成極大的威脅[6]。

本研究收集的200株非重復鮑曼不動桿菌中CRAB占比從2017年的18.2%增長到2019年的28.1%，呈逐年增長的趨勢，但低于李荷楠等[7]、張瑞玲等[8]的報道。47株CRAB標本類型來源廣泛，其中呼吸道標本(痰液)占比最高(80.9%)，呼吸系統(tǒng)是北京市昌平區(qū)醫(yī)院收治患者的CRAB主要感染部位，與相關文獻報道一致[8-10]。CRAB臨床科室來源以內(nèi)科重癥監(jiān)護室 (66.0%)為主，主要是感染免疫力低下的危急重癥老年患者，也與相關報道相符[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRAB不僅對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，對其他β-內(nèi)酰胺類藥物及含酶抑制劑復合抗菌藥物的耐藥率也很高。47株CRAB的藥敏試驗結(jié)果顯示，其對臨床常用的頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、氨芐西林/舒巴坦、慶大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星等抗菌藥物均具有極高的耐藥率；對替加環(huán)素的耐藥率為40.0%，也應引起足夠的重視。姚丹玲等[11]研究指出，替加環(huán)素聯(lián)合其他抗菌藥物治療CRAB感染并沒有明顯減少患者28 d的病死率，這些都給臨床治療帶來了極大困難。由于危重癥患者長期臥床、住院且多為高齡，呼吸道經(jīng)常有大量細菌定植，臨床醫(yī)生應合理選用抗菌藥物，根據(jù)患者的臨床癥狀、實驗室指標、影像學表現(xiàn)等綜合分析來自呼吸道標本的CRAB是致病菌還是定植菌，以減少不恰當?shù)闹委煷胧煌瑫r，實驗室工作人員必須通過涂片及染色正確評價呼吸道標本的質(zhì)量，嚴格拒收不合格標本，多進行微生物標本送檢知識的宣傳，提高臨床醫(yī)生無菌體液標本的送檢意識。

MLST是基于核酸序列進行細菌分型的方法，其操作比較簡單，重復性也高，對長時期和大范圍的同源性分析非常適用[12]。本研究經(jīng)MLST共獲得4種ST，其中以ST208和ST195為主，分別占53.2%和40.4%，均屬于CC92，且暫未發(fā)現(xiàn)新的克隆菌株。根據(jù)報道，CRAB最主要的克隆復合體是CC92，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，在我國多個地區(qū)和不同醫(yī)院也有分離[13-14]。不同ST在國內(nèi)分布呈現(xiàn)地理差異性，CC92克隆復合體的傳播可跨地區(qū),具有極強的耐藥性，這些菌株還可以在臨床抗菌藥物壓力下繼續(xù)存在，有極強的院內(nèi)流行傳播能力，研究CRAB分離株的分子流行病學對于預防醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)尤為重要[15]。每個地區(qū)除了要預防本地流行菌株的暴發(fā)外，防止外來流行克隆株的入侵同樣是重點關注的方向。

鮑曼不動桿菌的耐藥機制眾多，包括產(chǎn)生各種β-內(nèi)酰胺酶、外排基因的過度表達、膜通透性的下降、水解酶的產(chǎn)生、生物膜的形成等[16]，如此復雜的耐藥機制是CRAB在院內(nèi)迅速傳播的原因之一，這也是今后要持續(xù)研究探索的方向。

綜上所述，北京市昌平區(qū)醫(yī)院檢出的鮑曼不動桿菌中CRAB的占比逐年升高，耐藥形勢不容樂觀，定期進行流行病學監(jiān)測有助于了解CRAB感染暴發(fā)流行的實際情況，能更好地為臨床診治提供可靠的依據(jù)，有利于醫(yī)院內(nèi)感染防控措施的制訂與執(zhí)行。