道真縣兔場(chǎng)兔球蟲(chóng)感染情況調(diào)查

李曉蕓 ,程振濤

（1.道真仡佬族苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 遵義 563500；2.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

兔球蟲(chóng)病是由艾美耳屬的多種球蟲(chóng)寄生于家兔的腸道和肝臟所引起的一種原蟲(chóng)病，兔感染該病后主要癥狀為腹瀉、消瘦，甚至死亡，為嚴(yán)重危害家兔的一種常見(jiàn)多發(fā)性疾病。不同品種、不同年齡段的兔均易感，其中，斷奶至3月齡的幼兔最易發(fā)病，死亡率可達(dá)80%，患病耐過(guò)的兔生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響，降低兔的生產(chǎn)性能，成年兔感染球蟲(chóng)后多數(shù)不發(fā)病而成為帶蟲(chóng)兔[1]，該病的流行會(huì)給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，兔球蟲(chóng)病目前已在國(guó)內(nèi)廣泛流行，JING 等[2]報(bào)道，全國(guó)14 個(gè)省兔球蟲(chóng)總感染率為41.9%；姜英等[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河南省11 個(gè)地區(qū)兔球蟲(chóng)平均感染率為74.6%；李潔等[4]發(fā)現(xiàn)，新疆5 個(gè)地區(qū)兔球蟲(chóng)總感染率為75.7%；任永軍等[5]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川省5 個(gè)地區(qū)兔球蟲(chóng)平均感染率為61%。目前公認(rèn)的兔球蟲(chóng)種類有11 個(gè)有效種[6-7]，但不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種在一定程度上有所不同[3,5]，這與不同地區(qū)地理位置、氣候條件等因素有關(guān)。PCR 技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可準(zhǔn)確鑒定出不同種類的兔球蟲(chóng)。目前，有關(guān)貴州省內(nèi)兔球蟲(chóng)感染情況的研究較少。因此，對(duì)道真仡佬族苗族自治縣2個(gè)兔場(chǎng)兔球蟲(chóng)感染情況和感染種類進(jìn)行調(diào)查，以期為當(dāng)?shù)赝们蛳x(chóng)病防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 兔糞便樣品 來(lái)自于道真2 個(gè)不同兔場(chǎng)，分別位于平模鎮(zhèn)順河村、隆興鎮(zhèn)前進(jìn)村，共77 份兔糞便。按照兔只存欄數(shù)5%的比例隨機(jī)采集1～3月齡、3～6月齡和6月齡以上兔群新鮮糞便，每份糞便20 g 左右，每采1 份樣品更換1次手套，裝入潔凈的一次性自封袋內(nèi)，標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4℃保存待檢。

1.1.2 試劑 氯化鈉（分析純），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；糞便基因組DNA 提取試劑盒，江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2000 DNA Maker均購(gòu)自Takara公司。

1.1.3 主要儀器 生物顯微鏡（上海滬譽(yù)儀器有限公司）；PCR 儀（杭州柏恒科技有限公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）；電泳凝膠成像儀（成都錦世昌祥科技有限公司）；麥?zhǔn)舷x(chóng)卵計(jì)數(shù)板（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海寄生蟲(chóng)病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 兔球蟲(chóng)感染率及感染強(qiáng)度 稱取兔糞便2 g，放入50 mL 燒杯中，加入適量水?dāng)噭?，?jīng)80 目網(wǎng)篩過(guò)濾，用少量水沖洗3～5 次濾網(wǎng)，將濾液轉(zhuǎn)移至新的50 mL 離心管，2 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，加入少量飽和鹽水溶液將沉淀物攪勻，全部轉(zhuǎn)入比色管，加飽和鹽水至60 mL 處，靜置10 min，用移液槍吸取液面糞液，注滿麥?zhǔn)舷x(chóng)卵計(jì)數(shù)板的2個(gè)計(jì)數(shù)室，將計(jì)數(shù)板置于顯微鏡的載物臺(tái)上靜置5 min 后在低倍（10×10）顯微鏡下觀察球蟲(chóng)卵囊情況，計(jì)算球蟲(chóng)感染率及感染強(qiáng)度。每克糞便卵囊數(shù)（OPG）=2 個(gè)計(jì)數(shù)室中卵囊數(shù)的平均數(shù)×200。兔球蟲(chóng)感染強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：OPG＞10×104為嚴(yán)重感染；1×104≤OPG≤10×104為中度感染；OPG＜1×104為輕度感染。

1.2.2 兔球蟲(chóng)感染種類 每個(gè)兔場(chǎng)取4 份兔球蟲(chóng)陽(yáng)性糞便樣品進(jìn)行PCR 測(cè)定，樣本1～4來(lái)自順河村兔場(chǎng)，樣本5～8來(lái)自前進(jìn)村兔場(chǎng)。

1）糞便基因組DNA 提取。使用糞便基因組DNA 提取試劑盒對(duì)兔球蟲(chóng)陽(yáng)性糞便進(jìn)行總DNA 提取，具體提取過(guò)程參照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2）PCR 擴(kuò)增。根據(jù)GenBank 中公布的5 種兔艾美耳球蟲(chóng)參考蟲(chóng)株的基因序列，分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物信息見(jiàn)表1。以提取的總DNA 為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物，構(gòu)建PCR 反應(yīng)體系50 μL 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（每個(gè)反應(yīng)均添加陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品），PCR 產(chǎn)物在含Goldview 的1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 兔艾美耳球蟲(chóng)PCR擴(kuò)增引物信息

3）目的基因測(cè)序及分析。PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的基因片段送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，所得堿基序列上傳NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)，根據(jù)序列核苷酸同源性鑒定艾美耳球蟲(chóng)的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔球蟲(chóng)感染情況

經(jīng)飽和鹽水漂浮法和顯微鏡觀察，77 份兔糞便中有55 份檢出兔球蟲(chóng)卵囊，總感染率為71.4%，感染強(qiáng)度為中度感染，調(diào)查的2 個(gè)兔場(chǎng)均不同程度感染球蟲(chóng)，感染具體情況見(jiàn)表2。不同年齡段兔感染球蟲(chóng)情況如表3 所示，1～3月齡幼兔感染率最高，達(dá)96.9%，且多呈中度或重度感染。

表2 不同兔場(chǎng)兔球蟲(chóng)感染情況

表3 不同年齡段兔感染球蟲(chóng)情況

2.2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖1～5 可知，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，穿孔艾美耳球蟲(chóng)、維氏艾美耳球蟲(chóng)和大型艾美耳球蟲(chóng)均與預(yù)期的球蟲(chóng)基因大小一致，而腸艾美耳球蟲(chóng)和小型艾美耳球蟲(chóng)均無(wú)條帶出現(xiàn)，表明感染的兔球蟲(chóng)是穿孔艾美耳球蟲(chóng)、維氏艾美耳球蟲(chóng)和大型艾美耳球蟲(chóng)。

圖1 兔場(chǎng)穿孔艾美耳球蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

圖2 兔場(chǎng)維氏艾美耳球蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

圖3 兔場(chǎng)小型艾美耳球蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

圖4 兔場(chǎng)腸艾美耳球蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

圖5 兔場(chǎng)大型艾美耳球蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果

2.3 目的基因序列測(cè)定與分析結(jié)果

對(duì)所得堿基序列上傳NCBI進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，感染的兔球蟲(chóng)是穿孔艾美爾球蟲(chóng)、維氏艾美耳球蟲(chóng)和大型艾美耳球蟲(chóng)。將試驗(yàn)分離到的艾美耳球蟲(chóng)蟲(chóng)株分別命名為DZ-E.perforans、DZ-E.vejdovskyi、DZ-E.magna，并與艾美耳球蟲(chóng)參考蟲(chóng)株進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，DZ-E.perforans與國(guó)內(nèi)外E.perforans蟲(chóng)株同源性最高，為97.8%～99.8%，DZ-E.vejdovskyi與國(guó)內(nèi)外E.vejdovskyi蟲(chóng)株同源性最高，為93.3%～94.7%，DZ-E.magna與國(guó)內(nèi)外E.magna蟲(chóng)株同源性最高，為98.7%～99.0%。

3 小結(jié)與討論

目前，兔球蟲(chóng)病是兔場(chǎng)最常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)病，在規(guī)?；脠?chǎng)和散養(yǎng)戶均普遍存在。穆貞軍等[8]調(diào)查貴陽(yáng)市花溪區(qū)5 個(gè)兔場(chǎng)，兔球蟲(chóng)總感染率為81%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，道真兔場(chǎng)兔球蟲(chóng)總感染率為71.4%，感染率較高。道真縣1～3月齡兔球蟲(chóng)總感染率為96.9%，明顯高于其他年齡段兔，與歐陽(yáng)昌勇等[9-10]的研究即兔球蟲(chóng)可感染不同年齡段兔，以斷奶至3月齡兔感染率最高的結(jié)果一致。鑒定出大型艾美耳球蟲(chóng)、穿孔艾美耳球蟲(chóng)和維氏艾美耳球蟲(chóng)，這與陳紅等[11]的研究即甘肅省5 個(gè)不同兔場(chǎng)鑒定出的3種優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種結(jié)果一致。

兔球蟲(chóng)病是養(yǎng)兔業(yè)中危害比較嚴(yán)重的一種兔病，對(duì)該病的防控需科學(xué)合理的藥物防治，并結(jié)合飼養(yǎng)管理和有效的衛(wèi)生消毒措施。一是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，飼喂?fàn)I養(yǎng)成分均衡的飼料，增強(qiáng)兔群抵抗力，注意兔場(chǎng)衛(wèi)生，糞便無(wú)害化處理，定期使用火焰消毒和消毒劑消毒；二是定期監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)球蟲(chóng)感染情況，根據(jù)感染情況變化科學(xué)合理用藥，同時(shí)根據(jù)季節(jié)性的發(fā)生特征調(diào)整用藥方案，在該病易爆發(fā)的季節(jié)可適當(dāng)加大藥物的預(yù)防劑量；三是做好病兔隔離治療，及時(shí)徹底消毒。必要時(shí)為迅速撲滅疫病，可撲殺病兔。在實(shí)際生產(chǎn)中，很難做到徹底清除兔場(chǎng)內(nèi)的球蟲(chóng)卵囊，但通過(guò)改善兔場(chǎng)內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和藥物防治等措施盡可能降低兔群中球蟲(chóng)卵囊的數(shù)量，可很大程度上減少兔球蟲(chóng)病的發(fā)生，且兔群接受低劑量球蟲(chóng)卵囊感染可激發(fā)兔群產(chǎn)生免疫保護(hù)力。