高效液相色譜法測定復方半夏片中橙皮苷含量

張東霞，張火旺

（廣東省河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517000）

復方半夏片由姜半夏、麻黃、遠志、桔梗、前胡、陳皮、白前、款冬花、細辛9味中藥組方。方中，陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰功效，常用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等；款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfaraL. 的干燥花蕾，具有潤肺下氣、止咳化痰功效，常用于治療新舊咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血等［1］199-200，346-347。橙皮苷是陳皮和款冬花的主要有效成分，為二氫黃酮衍生物，在提高人體免疫力、抗炎、抗菌、抗病毒、保護心血管系統等方面具有重要作用［2］。《中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑（第三冊）》WS3-B-0581-91 中僅有鑒別項［3］，難以控制其質量。為有效控制含橙皮苷的藥品質量［4-16］，本研究中建立了測定復方半夏片中橙皮苷含量的高效液相色譜法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；CPA225D 型電子天平（賽多利斯科學儀器< 北京> 有限公司，精度為十萬分之一）；DTC-15F 型超聲波清洗機（湖北鼎泰生化科技設備制造有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；UPW-20N型超純水器（北京歷元電子儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110721-202019，純度≥95.3%）；復方半夏片（河源市源城區譽盛大藥房，批號分別為210301028，210601015，210701036）；乙腈、磷酸均為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell PAK C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈 -0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：283 nm；進樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得質量濃度為0.206 6 mg/mL的對照品溶液。取樣品10 片，研細，取1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方及工藝［3］制備缺陳皮和款冬花陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2 項下3 種溶液各適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應吸收峰，且陰性對照無干擾。橙皮苷峰理論板數均大于6 000，分離度均大于2。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下對照品溶液1，3，5，7，10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1 708 158.63X+10 857.02（r= 1.000，n =5）。結果表明，橙皮苷進樣量在0.206 6～2.066 0 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.2 項下對照品溶液5μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結果的RSD為0.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為210301028）樣品適量，共6 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果橙皮苷含量的RSD為0.44%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為210301028）樣品適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為0.03%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為210301028）0.75 g，精密稱定，共 6 份，置 25 mL 容量瓶中，分別加入質量濃度為1.406 0，2.812 0，4.218 0 mg/mL的對照品溶液，平行2 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取 3 批（批 號 分 別 為 210301028，210601015，210701036）樣品各適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，每批樣品測3次，取平均值。結果樣品中橙皮苷含量分別為3.751 3，3.165 9，3.968 2 mg/g（n=3），故暫定復方半夏片中橙皮苷定量限為3.0 mg/g。

3 討論

3.1 提取方法選擇

以甲醇為溶劑，分別對同一批（批號為210301028）樣品超聲提取30，45，60 min。結果超聲30 min 和45 min時橙皮苷的含量較高，提取效果差異不明顯。故認為在超聲30 min時可基本提取完全。

3.2 流動相選擇

以橙皮苷常用流動相乙腈-水溶液、甲醇-醋酸-水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液進行預試驗。結果發現，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相時橙皮苷能與其他組分的色譜峰很好地分離，分離度符合要求，且峰形對稱而尖銳，理論板數達到6 000 以上。故確定乙腈 -0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）為流動相。

3.3 檢測波長選擇

采用二極管陣列檢測器，在190～400 nm 波長范圍內對橙皮苷對照品溶液進行掃描，結果在283 nm 波長處有最大吸收，與2020 年版《中國藥典（一部）》［1］199中橙皮苷的測定波長一致。故確定283 nm為檢測波長。

3.4 方法評價

本研究中建立的HPLC 法操作簡便、結果準確、穩定性好，可用于復方半夏片的質量控制。