FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中的表達研究*

譚秋芬，胡惠軍

廣東省惠州市第三人民醫院,廣東惠州 516002

乳腺癌在臨床中較為常見，是一種乳腺組織惡性腫瘤，主要是致癌因子作用于乳腺上皮導致細胞異常增殖[1-2]。乳腺癌發病的性別差異性顯著，絕大多數乳腺癌患者為女性，患者發病早期多表現為乳頭溢液、乳房腫塊等，病情發展至晚期會出現癌細胞轉移情況，對患者生命造成威脅[3]。研究顯示，瓣狀核酸內切酶-1(FEN1)是一種抑癌基因，若FEN1突變，會導致其修復和復制功能改變，誘發乳腺癌[4]；轉錄因子Ⅱⅰ假基因23(GTF2IP23)是一個多功能轉錄因子，參與生物發育、細胞生長、分化、轉錄和信號轉導等，介導惡性腫瘤發生和發展[5]；賴氨酸特異性去甲基化酶4A(KDM4A)被發現高表達于許多種類的癌癥中，可作為潛在的腫瘤治療的靶標[6]。本研究中對乳腺癌患者癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達進行檢測，旨在探究三者在乳腺癌中的表達相關性及聯合檢測對患者預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院于2020年7月至2021年8月進行手術的女性乳腺癌患者72例，年齡35～60歲，平均(47.5±9.8)歲，其中包括更年期患者51例，非更年期期患者21例；腫瘤直徑≤3 cm患者38例，腫瘤直徑>3 cm患者34例；無淋巴結轉移患者35例，有淋巴結轉移患者37例；無脈管侵犯患者40例，有脈管侵犯患者32例；病理分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期患者7例，Ⅳ期患者2例；癌組織分化程度：高分化32例，中分化29例，低分化11例。另選取本院同期進行手術的女性乳腺良性腫瘤患者70例，年齡36～58歲，平均(46.9±8.8)歲。本研究所有患者均知情同意并簽署知情同意書，獲本院倫理委員會批準。納入標準：(1)所有乳腺癌患者均符合中國抗癌學會對乳腺癌的診斷標準[7]；(2)均為首次確診；(3)未接受過相關治療；(4)良性乳腺腫瘤患者經本院病理檢查確診為良性腫瘤；(5)所有患者均接受手術治療；(6)病歷資料齊全。排除標準：(1)凝血障礙者；(2)處于妊娠期或哺乳期的女性；(3)近1個月內進行過重大手術者；(4)心腦血管疾病患者；(5)精神系統疾病患者。

1.2方法

1.2.1標本采集 收集乳腺癌患者手術切除癌組織、距癌組織5 cm癌旁組織標本及乳腺良性腫瘤患者腫瘤病理組織，將所取病理組織分成4 mm×4 mm大小標本并清洗3次，在甲醛溶液中浸泡、固定，進行脫水，處理后石蠟包埋，之后連續切片(厚度3 μm)做免疫組化標記。

1.2.2免疫組化染色 取制備好的乳腺癌組織、癌旁組織及乳腺良性腫瘤病理組織標本，脫蠟后清洗3次，使用檸檬酸修復液(100 ℃)浸泡15 min后取出靜置冷卻，以PBS液清洗3次，添加POD阻斷劑后常溫環境下孵育30 min后再次以PBS液清洗3次，滴加山羊血清封閉，30 min后吸出封閉液、添加一抗，稀釋至1∶2 000過夜保存。次日取出后使用PBS液清洗3次，添加二抗，稀釋至1∶5 000并完全覆蓋30 min，使用PBS液清洗3次之后添加DAB液，顯微鏡觀察，蘇木精染核，反藍、脫水處理后封片。一抗：兔抗人FN1單克隆抗體、兔抗人GTF2IP23單克隆抗體購自Millipore公司，兔抗人KDM4A單克隆抗體購自Signalway Antibody(SAB)抗體公司。二抗：驢抗兔FITC(波長492～520 nm)購自Millipore公司。

1.2.3反轉錄-實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測FEN1表達 Trizol法提取總RNA并測試完整性，以18S RNA為內參，其上游引物序列為：5′-CCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-CGCCCGCCCGCTCCCAAGAT-3′；FEN1上游引物序列為：5′-AAGGTCACTAAGCAGCACAAT-3′，下游引物序列為：5′-GTAGCCGCAGCATAGACTTTG-3′,反轉錄處理后進行PCR擴增。反應條件：預變性處理10 min；變性處理95 ℃ 10 s，退火63 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 10 s，進行42個循環。2-ΔΔCt方法計算FEN1相對表達水平。儀器使用ABI7500熒光定量PCR擴增儀[購自美國應用生物系統(ABI)公司]，FEN1抗體購于美國Abcam公司；所有操作均按照試劑盒說明進行。

1.2.4Western blot法檢測GTF2IP23、KDM4A表達 取待測標本，添加裂解液進行處理后取50 μg蛋白，煮至蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜處理后添加Western封閉液封閉3 h，添加一抗(1∶2 000)后4～6 ℃過夜孵育。次日使用Western液清洗后添加二抗(1∶5 000)孵育2 h，之后使用Western液進行清洗后進行顯色、曝光、成像，檢測條帶灰度值，檢測GTF2IP23、KDM4A相對表達水平。儀器使用電化學發光儀(購自上海啟步生物科技有限公司)。

2 結 果

2.1各組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達差異性分析 良性腫瘤組織、乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達水平均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1～3。

表1 各組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達水平比較

圖2 GTF2IP23表達免疫組化染色圖(×400)

圖3 KDM4A表達免疫組化染色圖(×400)

2.2乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達與臨床病理特征的關系 與非更年期、腫瘤直徑≤3 cm、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移、無脈管侵犯及高、中分化患者相比，更年期、腫瘤直徑>3 cm、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結轉移、脈管侵犯及低分化患者FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達與臨床病理特征的關系

2.3乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達相關性 乳腺癌組織中FEN1與GTF2IP23、KDM4A表達呈正相關(r=0.404、0.553，均P=0.001)；乳腺癌組織中GTF2IP23與KDM4A表達也呈正相關(r=0.582，P=0.001)。見圖4。

圖4 乳腺癌組織中FEN1、GTF2IP23、KDM4A表達相關性

2.4FEN1、GTF2IP23、KDM4A對乳腺癌患者預后的預測價值 與單項檢測相比，3項聯合檢測的靈敏度提高，特異度輕微降低，但曲線下面積(AUC)為0.899，大于FEN1、GTF2IP23、KDM4A單項診斷(0.691、0.659、0.708)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3、圖5。

表3 FEN1、GTF2IP23、KDM4A對乳腺癌患者預后的預測價值

圖5 FEN1、GTF2IP23、KDM4A對乳腺癌患者預后的預測價值ROC曲線圖

3 討 論

乳腺癌多發生在機體乳腺上皮組織中，而在人體生命活動中，乳腺組織的作用并不十分重要，因此乳腺組織切除對乳腺癌的治療效果比較理想[8-10]。乳腺癌患者若不及時治療，病情發展至晚期，癌細胞向全身擴散，會對患者生命造成威脅。乳腺癌的發病機制有多種，包括遺傳因素、基因突變、機體免疫功能下降、神經功能異常等，其中基因突變是乳腺癌發病的最主要因素，且腫瘤形成是一個涉及多基因、多步驟、長期的復雜過程，多種因素相互影響。因此許多專家學者通過分子生物學、病理研究等研究途徑對乳腺癌發病機制、診療靶點進行研究，對乳腺癌的診治進行不斷探索[11-13]。

FEN1是一種金屬核酸酶，具有結構特異性的特點，并且具有核酸外切酶、缺口核酸內切酶活性，能維持基因組完整、穩定。有研究指出，FEN1功能喪失將會導致慢性炎癥疾病及自身免疫疾病的誘發，并且在癌組織發展進程中起重要作用[14]。有研究表示，FEN1在口腔癌、肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤中有著異常的表達，其變化與癌細胞增殖能力變化相關，但其在乳腺癌組織中的研究還相對較少[15-16]。本研究顯示，相比癌旁組織、良性腫瘤組織，乳腺癌組織中FEN1表達相對較高，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，FEN1表達也逐漸升高，因此本研究認為FEN1在乳腺癌中高表達，可能參與乳腺癌的進展。本研究發現，處于恰當水平上的FEN1可通過DNA修復及抑制乳腺癌的基因突變，以保持基因組的穩定性。另外過表達的FEN1與ER結合影響了雌激素應答基因的表達，從而加速了乳腺癌進程。說明FEN1表達變化與乳腺癌患者病理特征、病情嚴重程度密切相關，由此可以推測出FEN1可能作為乳腺癌診斷、治療的靶點應用于臨床。

GTF2IP23為GTF2I家族的重要組成成員，GTF2IP23在細胞分化、生長等生物學行為上有重要作用。有研究表示，GTF2IP23能夠激活PI3K/AKT/MAPK通路，促進癌細胞的不斷增殖分化與侵襲，在惡性腫瘤的發生發展過程中具有重要作用[17-18]。GTF2IP23在肺癌、結腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均異常表達。本研究顯示，相比癌旁組織、良性腫瘤組織，乳腺癌組織中GTF2IP23表達相對較高，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，癌組織中GTF2IP23表達也逐漸升高。GTF2IP23屬于GTF2I的假基因，在乳腺癌中的表達最為顯著，而假基因通過抑制其母基因的表達，調控靶基因，促使乳腺組織癌變；并通過RNA結合蛋白或其他翻譯相關機制調控RNA表達或蛋白翻譯，致使蛋白變性、癌細胞增殖，加重乳腺癌病變程度。因此本研究推測GTF2IP23可能為乳腺癌發展演進的重要靶點，檢測GTF2IP23表達對乳腺癌診斷、治療具有重要意義。

KDM4A是KDM4家族的一種重要的去甲基酶，具有一定的調控基因轉錄的作用[19]。有研究表示，KDM4A在結直腸癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中呈異常表達，其異常高表達具有促進癌細胞增殖、分化、遷移的作用，在惡性腫瘤發生發展過程中具有重要作用[20-21]。本研究說明，KDM4A在乳腺癌組織中呈高表達，且隨著乳腺癌組織癌變程度的加深，癌組織中KDM4A表達也逐漸升高。KDM4A具有蛋白結合和去甲基酶活性兩種功能，可以與抑癌基因啟動子結合，負性調控癌癥因子轉錄，發揮抑癌功能，此時KDM4A升高，導致特異性蛋白1基因沉默，促使腫瘤轉移。KDM4A表達變化與乳腺癌病理特征具有密切聯系，因此本研究推測KDM4A可能為調控乳腺癌進展的重要分子。

本研究還發現，FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中表達呈正相關，三者聯合檢測對乳腺癌患者預后預測的靈敏度提高，特異度降低，說明三者可能共同參與乳腺癌的發展演進過程，與乳腺癌疾病相關，且認為三者線性相關，推測三者可能由于共同作用而誘導疾病的發生，對乳腺癌患者預后具有較高的預測價值。

綜上所述，FEN1、GTF2IP23、KDM4A在乳腺癌組織中均呈異常高表達，與乳腺癌患者病理特征密切相關，且三者表達具有一定相關性，FEN1、GTF2IP23、KDM4A水平三者聯合檢測對乳腺癌患者預后具有較高的預測價值，但本文樣本例數較少，且并未分析三者之間相互作用的機制，研究存在一定的局限性，因此還需后續研究進一步分析。