類鼻疽實驗室診斷的研究進展*

許珊珊，陳鑫蘋，肖 斌 綜述，符生苗△ 審校

1.海南醫學院附屬海南醫院醫學檢驗中心,海南海口 570311；2.海南省腫瘤醫院檢驗科/海南熱帶腫瘤研究所，海南海口 570312；3.廣州醫科大學附屬第六醫院/清遠市人民醫院檢驗醫學部,廣東清遠 511518

類鼻疽伯克霍爾德菌(Bp)是一種引起類鼻疽病的高致病性細菌，主要流行于東南亞及澳大利亞北部。近些年非流行地區零星報道病例增多，據估計，類鼻疽病每年造成的全球疾病負擔約為165 000例，其中89 000例死亡[1]。類鼻疽感染與職業及自身基礎疾病存在相關性。在高危人群中糖尿病為關聯性最強的易感因素，超過50%的類鼻疽患者都存在糖尿病[2-3]。類鼻疽平均潛伏期為9 d，但也有感染長達20年后發病，即所謂“潛伏型類鼻疽”。其臨床表現差異大，包括皮膚和軟組織膿腫、肺炎和感染性休克，后者的病死率超過80%，一半的類鼻疽死亡發生在就診后的前48 h內[4]。由于缺乏快速的實驗室診斷方法，只能通過臨床癥狀及流行病學史經驗性地進行靶向治療。該細菌對多種抗菌藥物存在天然耐藥，使用無效的抗菌藥的治療可能導致病死率(CFR)超過70%。面對非特異性的臨床表現，及早診斷顯得尤為重要，故本文將對類鼻疽的實驗室診斷方法進行介紹。

1 分離培養法

當前診斷類鼻疽的金標準仍是細菌培養。將被正常菌群污染的樣本接種到選擇性培養基(如Ashdown瓊脂或洋蔥伯克霍爾德菌瓊脂)上，提高了被正常菌群污染的標本中Bp檢出率[5]。培養法需要經驗豐富的微生物學家和嚴格的實驗室安全程序，耗時長、靈敏度差、陽性率低、早期診斷易漏診。使用生化表型鑒定系統進行識別診斷的準確性約為80%，VITEK 2系統常將Bp誤認為洋蔥伯克霍爾德菌，且該系統在屬級水平上的錯誤識別率很高。API 20NE系統具有明顯的地域差異，Bp通常被錯誤鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌或紫色色桿菌，且該系統需要至少24 h才能得出結果，作為篩選方法不太令人滿意[6-7]。

2 血清學檢測

血清學檢測易于執行且價格低廉，可以減少實驗室診斷的時間。即時診斷是早期診斷的關鍵，近些年正在開發和評估越來越多的非培養類鼻疽快速診斷技術，血清學檢測用于開發即時診斷具有更廣闊的前景。目前血清學檢測主要包括間接血凝試驗(IHA)[8]、乳膠凝集試驗(LAT)[9-10]、免疫熒光分析(IFA)[11-12]、快速免疫色譜檢測(ICT)[13]、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、側向流動免疫測定法(LFI)[14]和蛋白質微陣列技術[15]等。

IHA由于靈敏度不高，且對感染銅綠假單胞菌患者檢測結果存在假陽性，因此該方法僅用于沒有類鼻疽流行地區居住史并且曾進行過一次或少量離散到訪而可能發生暴露的旅行者。LAT與泰國伯克霍爾德菌和洋蔥伯克霍爾德菌產生交叉反應，只能作為一種初篩試驗[10]。雖然IFA法具有較佳的靈敏度(92.6%)及特異度(100.0%)但不能直接檢測全血或血清樣本，且對設備及人員有較高的要求，適合在初篩的基礎上使用該方法作為判斷依據。ICT檢測的是溶血素共調節蛋白(Hcp1)的IgG抗體，其操作簡便、耗時短，可用于流行病學調查及現場診斷。雖然Hcp1已被證實是宿主體液免疫反應的重要靶標，但在免疫功能低下或診斷時間過早時均有可能出現假陰性[16]。針對性地檢測Hcp1的IgM是否會提高類鼻疽診斷的靈敏度和特異度，或運用Hcp1的IgG和IgM能否可靠區分現癥感染與既往感染有待進一步研究。

外膜蛋白(ompA)[17]、伴侶蛋白(rGroEL)[17]、莢膜多糖(CPS)[18]、O-多糖(OPS)[18]、鞭毛蛋白(FLAG300)、Hcp1[19]等是常用的Bp抗原，其中Hcp1及OPS是開發快速即時檢測的具有前景的候選靶抗原。處在流行地區的人群血清背景陽性率高，rGroEL在健康人群中表現出較少的抗體反應，這一特征使其應用在流行地區具有很高的陰性預測價值，但與假單胞菌屬和其他非發酵革蘭陰性桿菌(GNF)存在交叉反應，需要進一步優化抗原以提高檢測的準確性。免疫磁珠(IMB)聯合ELISA(IMB-ELISA)的方法靈敏度低，耗時久且與大腸桿菌顯示出模糊的交叉反應故不推薦使用[20]。單獨應用LFI檢測類鼻疽靈敏度不高，CPS-LFI和Hcp1-ELISA或OPS-ELISA聯合診斷類鼻疽，可提高檢測的靈敏度[21]。InBios公司開發的橫向流動檢測法(AMD-LFI)在檢測尿液樣本時顯示假陽性結果，考慮是源于尿液中的CPS負荷低，可使用尿液濃縮器提高AMD-LFI的靈敏度[22-23]，隨后優化出AMD-Plus檢測系統，測試中未出現早期的假陽性尿帶[24]。Bp CPS半衰期短且可快速排泄至尿液，使用尿液檢測的AMD-LFI陽性可提示活動性的類鼻疽感染，根據這一特點，持續性檢測AMD-LFI可監控患者病情進展及用藥療效。

基于20種類鼻疽抗原開發的蛋白質微陣列是對類鼻疽患者血清中短期和長期抗體的多重檢測[15]。其靈敏度(86.7%)明顯高于IHA(57.3%)。標準化的微陣列裝置簡單、檢測方便、速度快，適于常規診斷實驗室應用。

3 分子生物學檢測

由于血清學檢測方法依賴于抗體滴度，靈敏度及特異度不穩定。鑒于病原體檢測的研究熱點應是開發更加簡便的分子生物學檢測方法，縮短檢測時間且不影響檢測結果的準確性。

3.1聚合酶鏈反應(PCR) 目前PCR常用靶標Ⅲ型分泌系統研究基因簇(TTS1)內orf2，最常見的是通過實時熒光定量PCR(qPCR)方法直接從臨床樣本中檢測病原體，qPCR是當前定量最準確、重復性最好的核酸檢測技術。ZUETER等[25]運用TTS1基因簇中的orf1-stcQ作為PCR擴增的靶標，檢測菌株的靈敏度和特異度均為100.00%，血培養中的檢測限為18.4×105CFU/mL。但是基于單基因檢測會出現假陰性結果，開發多基因多重靶點檢測可以提高靈敏度。SEMAIL等[26]首次篩選Bp的6型分泌系統5(T6SS-5),建立了測定7種基因(tss C-5、tag D-5、tss A-5、hcp -5、tss B-5、tss F-5和vgrG-5)的多重PCR檢測方法。經優化后臨床分離株的靈敏度為93.80%，特異度為100.00%。7種基因中除tss F-5檢出限為105CFU/mL外，其他靶標基因均能檢測到103CFU/mL，這與RPA的靈敏度相當。該多重PCR技術不僅可以應用于類鼻疽的實驗室診斷，同時能進一步了解Bp的毒力機制，對類鼻疽的治療提供新的思路。由于該方法未對臨床樣本進行檢測，尚不能確定是否所有的Bp都存在T6SS-5基因，對其實際應用的可能性需進一步評估。

等溫熱隔絕式聚合酶鏈式反應(iiPCR)是一種基于熒光水解探針的低成本的對流PCR，該方法已被開發應用于檢測瘧疾[27]、登革熱病毒[28]等。CHUA等[29]開發的針對靶標bimA基因的iiPCR表現出高度特異度(100.00%)及靈敏度(97.52%)，檢測限為14 ng/μL，bimA在鼻疽伯克霍爾德菌及泰國伯克霍爾德菌中存在明顯差異，這對于區分與Bp密切相關的伯克霍爾德菌屬具有極大的價值。便攜的核酸分析儀可利用電池供電，適用于現場診斷。由于該方法檢測的伯克霍爾德菌屬菌株數量有限，且未對洋蔥伯克霍爾德菌進行鑒定，未來應進一步證實iiPCR的特異度。

3.2環介導等溫擴增(LAMP) CHANTRATITA等[30]以TTS1基因簇為靶點的環介導等溫擴增法檢測類鼻疽，結果表明LAMP比qPCR的靈敏度更高,檢測限達到38 拷貝/反應，如將LAMP與納米生物傳感器(LFB)結合可更便捷地讀取結果[31]。TZELING等[32]使用兩組不同的引物和特定雙功能寡核苷酸(DFO)建立了一種多重實時LAMP檢測，可同時檢測類鼻疽和惡性瘧原蟲。DFO-LAMP檢測的DNA的最小濃度為1 fg，比傳統的多重LAMP(10 fg/μL)更敏感，且未發生交叉反應，特異度為100.00%。因此，多重LAMP為核酸診斷技術提供了一種簡便、可靠、快速、高度靈敏和特異度的方法。

3.3重組酶聚合酶擴增(RPA) RPA能夠在25～50 ℃的溫度范圍內將DNA擴增至可檢測水平，在低資源環境現場應用是一個很大的優勢。PENG等[33]通過靶向TTS1-orf2基因建立重組酶聚合酶擴增技術結合橫向流動試紙檢測法(LF-RPA)，LF-RPA和qPCR檢測臨床樣本的檢測限均為4.2×103CFU/mL，且LF-RPA對血液中的抑制劑更具耐受性。SAXENA等[34]使用Bp菌株K96243的BPSS1399上游的DNA序列(251 bp)作為靶標序列，在血液和尿液樣本中檢測限為4.8×104CFU/mL和4.95×104CFU/mL，與先前的LF-RPA相比表現更佳。氣溶膠污染是困擾核酸檢測的一大難題，在操作時應嚴格分區，否則容易造成假陽性，LI等[35]和ZHAO等[36]不僅開發了一種簡便可視裝備與LF-RPA相結合既能減少假陽性，而且引物經優化后的檢測結果更好，與實時PCR具有相同的靈敏度，與16S rRNA基因測序結果無顯著差異，具有高度特異度(100.00%)。與LAMP相比，RPA的引物設計較為簡便。由此可見，LF-RPA是當今基于PCR技術檢測類鼻疽的替代方法。

3.4多重交叉置換擴增(MCDA) WANG等[37]將MCDA技術與基于納米顆粒的生物傳感器(NB)相結合，在純培養物DNA的檢測限為10 fg，特異度為100.00%，且經臨床樣本評估MCDA-NB的診斷準確性與金標準培養法相符合。MCDA-NB無需使用特殊的儀器設備便可快速獲取結果，對于基層及現場應用具有極大幫助。

3.5基因測序 16S rRNA基因序列可以有效區分類鼻疽和鼻疽。對于Bp與泰國伯克霍爾德菌，groEL基因核苷酸序列顯示<97.6%的同一性，具有更高的鑒別價值[38]。全基因測序不僅可以準確鑒別類鼻疽，及時發現突變的細菌，有效指導臨床治療，還可用于尋找傳染源、傳播途徑，預測疾病傳播風險，在流行病防控方面具有重要意義[39]。

3.6自動化分子診斷平臺 GASSIEP等[40]首次使用Panther fusion自動化分子診斷儀器直接檢測全血樣本中的Bp，檢測限為1.64×103CFU/mL，但由于靈敏度較低，該方法僅適用于血培養陽性診斷。自動化分子診斷平臺可以有效降低勞動成本、處理樣本時間、樣本污染風險，未來可以尋找其他的分子靶點以提高檢測的靈敏度。

4 其他檢測方法

4.1質譜法 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF MS)可以準確地鑒定Bp并區分其他的伯克霍爾德菌屬，也可用于流行病學研究，對Bp及其相關物種的發現和分布，還能區分野生型和突變體。MALDI-TOF MS在澳大利亞和中國的研究具有良好的靈敏度和特異度[41-42]，但由于Bp存在較高的遺傳多態性，為了進一步評估MALDI-TOF MS的準確性，WATTHANAWORAWIT等[43]在RUO模式下使用Vitek MS創建用于Bp鑒定的超光譜，并針對來自類鼻疽流行的3個國家的分離株進行研究，結果顯示來自東南亞和澳大利亞的分離株100.0%能正確識別。MALDITOF-MS鑒定的準確性取決于數據庫的信息量，需要不斷完善相關數據庫以提升微生物鑒定在臨床中的診斷價值。

4.2上轉發光免疫層析法(Bps-UPT-LF) 利用上轉發光材料結合雙抗體夾心法制備出Bps-UPT-LF類鼻疽檢測試紙，該技術靈敏度高，且對104～107CFU/mL的Bp可進行精準定量[44]。基于Bps-UPT-LF試紙耐受性強、操作簡便、快速，運用于現場環境檢測更有優勢。

4.3支持向量機(SVM) 研究發現中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞水平的變化與類鼻疽發生和發展密切相關[45]。鑒于以上特點，XU等[46]建立了由CD8+T細胞、靜息CD4+記憶T細胞、單核細胞、M2巨噬細胞和活化肥大細胞組合而成的新型SVM模型用于檢測敗血癥性類鼻疽。該方法的成本相對較低，表現出高度特異度及靈敏度，可以作為改進類鼻疽檢測和診斷的補充。

5 結語與展望

隨著人口和病原體的移動增加了新地區流行的風險，類鼻疽的全球負擔不斷增加。對類鼻疽的診斷不應局限于臨床樣本，環境樣本也應納入考慮，對環境進行檢測可以擴大類鼻疽的全球風險圖，有效監控疾病的發生。預防和降低受影響個體的死亡率是類鼻疽研究的兩個關鍵課題。快速實驗室診斷有助于早期使用恰當的抗菌藥物進行治療，從而可能降低因延遲治療而導致的死亡率。實現對類鼻疽的早期發現、早期診斷、早期治療是當前及未來的努力目標。由于目前還沒有市售且可靠的類鼻疽即時診斷技術，因此開發簡便、靈敏，能夠快速識別分離株并直接檢測臨床標本的診斷方法是未來主要的研究方向，其中，優化出簡便的分子生物學方法將對類鼻疽流行地區和資源匱乏地區的病情進行監控，提供有效治療，遏制疾病的蔓延均有極大的幫助。