腦脊液miR-139、miR-22水平對肺腺癌腦轉移瘤的診斷價值研究*

代洛陽，劉玉潔，許 可，李 濤△，龔虹云

武漢大學人民醫院：1.神經內科;2.腫瘤中心，湖北武漢 430060

腦轉移瘤是惡性腫瘤的一種并發癥，是導致腫瘤患者死亡的重要原因。有研究顯示，非小細胞肺癌是腦轉移瘤的原發腫瘤之一，非小細胞肺癌患者腦轉移的發生率超過20%[1]。肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的亞型，約占肺癌患者的40%，與其他亞型的非小細胞肺癌相比，其發生早期遠處轉移和腦轉移的概率較高[2]。腦轉移瘤是肺腺癌預后不良的危險因素，會使患者中位生存時間顯著減少[3]，因此找尋新的特異性診斷標志物和治療靶點，對早期診斷和治療肺腺癌腦轉移瘤具有重要的價值。研究發現微小RNA(miRNA)的異常表達與多種疾病發生密切相關，miRNA參與腫瘤的發生、發展過程，是疾病早期診斷的潛在生物標志物[4]。miR-139在乳腺癌組織及癌細胞中低表達，是浸潤性乳腺癌治療的潛在靶點[5]。miR-139-5p有抑癌作用，與非小細胞肺癌臨床病理參數相關[6]。miR-22同有抑癌作用，在上皮性卵巢癌患者血清中低表達，可作為卵巢癌早期診斷的生物標志物[7]。YANG等[8]研究顯示，miR-22-3p模擬物可抑制肺癌細胞增殖并促進其凋亡。miR-139、miR-22均參與了非小細胞肺癌的發生、發展過程，與癌細胞增殖、轉移相關，但它們是否與肺腺癌腦轉移瘤發生有關目前報道較少。本研究通過檢測肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液miR-139、miR-22水平，探討其對肺腺癌腦轉移瘤的診斷價值，以期為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2021年12月本院收治并確診為肺腺癌腦轉移瘤患者80例作為肺腺癌腦轉移組，男43例、女37例，年齡47～78歲，平均(60.26±7.13)歲，其中吸煙者30例。另外，選取同期單純肺腺癌無轉移患者60例作為肺腺癌無轉移組，男35例、女25例，年齡46～80歲，平均(60.37±6.94)歲，其中吸煙者25例。納入標準：(1)符合肺腺癌診斷標準[9]，且經組織病理學證實；(2)經顱腦磁共振檢查診斷為腦轉移；(3)為初治患者，進行本研究前未行放、化療等相關治療；(4)有完整臨床資料的患者。排除標準：(1)有代謝性或傳染性疾病；(2)肝、腎等重要臟器功能不全；(3)有其他惡性腫瘤病史。肺腺癌腦轉移組和肺腺癌無轉移組比較，年齡、性別、吸煙史差異均無統計學意義(P>0.05)，原發腫瘤數目、原發腫瘤分化程度、淋巴結轉移差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。本研究經醫院倫理委員會批準同意，患者及家屬均簽署知情同意書。

表1 肺腺癌無轉移組和肺腺癌腦轉移組一般資料比較

1.2方法

1.2.1腦脊液標本收集 患者在進行腰椎穿刺或鞘注化療時，抽取腦脊液10 mL置于無菌離心管中，于-20 ℃保存，待測。

1.2.2實時熒光定量PCR測定腦脊液中miR-139、miR-22水平 采用Trizol試劑[購自上海通蔚生物有限公司，批號：KM10574]提取腦脊液總RNA。然后，將其反轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增反應。反轉錄試劑盒(批號J-6041L)和PCR試劑盒(批號M-3017L)均購自北京索萊寶科技有限公司。操作步驟嚴格按照說明書執行，以U6為內參，反應條件：50 ℃預變性2 min；95 ℃ 5 s，70 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40個循環。引物由上海通蔚生物有限公司合成，引物序列見表2。用2-ΔΔCt法計算miR-139、miR-22相對表達水平。

表2 引物序列

1.2.3肺腺癌細胞培養、轉染及分組 人肺腺癌細胞株A549購自武漢尚恩生物技術有限公司(批號：CSA-30172)。A549細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中，在含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中培養。A549細胞在不含抗菌藥物的完全培養基中培養24 h后，根據Lipofectamine 3000試劑盒(武漢尚恩生物技術有限公司，批號：CSA-60157)說明書，將購自武漢華聯科生物公司的miR-139模擬物(mimic)、miR-22 mimic、miR-139抑制物(inhibitor)、miR-22 inhibitor分別以50 nmol/L的濃度轉染至A549細胞，依次記為miR-139 mimic組、miR-22 mimic組、miR-139 inhibitor組、miR-22 inhibitor組，另以未轉染的正常A549細胞作為對照(Control)組。轉染48 h后，收集各組A549細胞，用Trizol試劑提取總RNA，然后按照1.2.2中的方法檢測miR-139、miR-22的水平，以此判斷轉染是否成功。各組均設6個平行檢測樣本。

1.2.4Transwell實驗評價肺腺癌細胞侵襲能力 轉染48 h后收集細胞，88 μm孔徑的插入物被放置在24孔板中，以分離上腔與下腔。上腔預涂基質膠后，加入含(3～5)×104個細胞的細胞懸液200 μL，下腔加入含20%FBS的DMEM培養基500 μL，侵襲下腔的細胞用70%甲醇固定，24 h后用0.5%結晶紫處理，于倒置顯微鏡(北京誠聚德生物技術有限公司，型號IX83)下計數侵襲細胞數。

1.2.5細胞劃痕實驗檢測肺腺癌細胞遷移能力 轉染48 h后收集細胞，均勻鋪種于6孔板中，細胞貼壁后，用200 μL無菌槍頭垂直劃過板底的細胞層，形成劃痕，滴加無菌PBS洗滌去除漂浮細胞，即刻在光鏡下拍照，標記為0 h，加入2 mL含1% FBS的培養基繼續培養24 h后，光鏡下拍照觀察劃痕愈合情況，標記為24 h。采用ImageJ軟件測量劃痕距離，劃痕愈合率可表示細胞遷移能力(劃痕愈合率越高代表細胞遷移能力越強)，劃痕愈合率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

2 結 果

2.1肺腺癌無轉移組和肺腺癌腦轉移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平比較 與肺腺癌無轉移組相比，肺腺癌腦轉移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 肺腺癌無轉移組和肺腺癌腦轉移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平比較

2.2肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與臨床病理參數的關系 根據肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平的平均值(分別為0.76、0.77)將其進行分組：miR-139高表達組35例(miR-139≥0.76)，miR-139低表達組45例(miR-139<0.76)；miR-22高表達組32例(miR-22≥0.77)，miR-22低表達組48例(miR-22<0.77)。肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與年齡、性別、是否吸煙無關(P>0.05)，與原發腫瘤數目、原發腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關(P<0.05)，見表4。

表4 肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與臨床病理參數的關系[n(%)]

2.3肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平的相關性分析 Pearson相關分析顯示，肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139與miR-22水平呈正相關(r=0.432，P=<0.001)，見圖1。

圖1 肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平的相關性分析

2.4影響肺腺癌患者發生腦轉移瘤的危險因素分析 將2.2中有統計學意義的變量(原發腫瘤數目、原發腫瘤分化程度、淋巴結轉移、miR-139、miR-22)行多因素Logistic回歸分析，結果顯示：多個原發腫瘤、原發腫瘤低分化、淋巴結轉移、miR-139低表達、miR-22低表達是肺腺癌患者發生腦轉移瘤的獨立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 Logistic回歸分析影響肺腺癌患者發生腦轉移瘤的危險因素

2.5腦脊液中miR-139、miR-22水平對肺腺癌患者發生腦轉移瘤的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，腦脊液中miR-139、miR-22單獨及二者聯合診斷肺腺癌患者發生腦轉移瘤的曲線下面積(AUC)分別為0.827、0.795、0.953，二者聯合優于miR-139、miR-22各自單獨診斷(Z=1.766、2.178，P=0.038、0.029)。見圖2、表6。

表6 腦脊液中miR-139、miR-22水平對肺腺癌患者發生腦轉移瘤的診斷價值

圖2 腦脊液中miR-139、miR-22水平診斷肺腺癌患者發生腦轉移瘤的ROC曲線

2.6miR-139、miR-22高低表達對肺腺癌細胞侵襲、遷移的影響 與Control組相比，miR-139 mimic組miR-139、miR-22 mimic組miR-22水平均顯著升高(P<0.05)，miR-139 mimic組和miR-22 mimic組侵襲細胞數、劃痕愈合率顯著降低(P<0.05)；與Control組相比，miR-139 inhibitor組miR-139、miR-22 inhibitor組miR-22水平顯著降低，miR-139 inhibitor組和miR-22 inhibitor組侵襲細胞數、劃痕愈合率顯著增加(P<0.05)。見圖3、表7。

圖3 各組肺腺癌細胞侵襲(結晶紫染色，×200)和遷移(×100)圖

表7 miR-139、miR-22高低表達對肺腺癌細胞侵襲、遷移的影響

3 討 論

腦轉移瘤是惡性腫瘤致死性并發癥，常發生在肺腺癌晚期，會引起中樞神經系統受累，造成機體神經功能異常。目前，臨床對于肺腺癌患者治療多采用放療和化療，以提高腫瘤局部控制率和延長患者生存期，但發生腦轉移的概率增加[10]。腦轉移患者的預后較差，若不予治療，多數患者死于神經功能系統衰退。miRNA是一種短鏈非編碼RNA，與腫瘤的發生緊密相關，miRNA可以通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區結合調節其降解蛋白或抑制蛋白翻譯，參與腫瘤細胞增殖、分化、遷移、侵襲等各個階段，可作為潛在的腫瘤診斷生物學標志物。

miR-139是一種腫瘤抑制因子，在肺鱗癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤等多種癌組織和細胞中表達下調。ZHANG等[11]研究顯示，miR-139-5p在非小細胞肺癌細胞和組織中表達顯著下調，在體外miR-139-5p過表達可顯著抑制癌細胞的活力和增殖并誘導其凋亡，抑制miR-139-5p表達可以促進非小細胞肺癌細胞增殖和化療耐藥性的產生。提示，miR-139與非小細胞肺癌的發生、發展有關。miR-22位于第17號染色體上，由22個核苷酸組成。miR-22的表達失調與多種癌癥疾病發生、發展過程密切相關。WONGJAMPA等[12]研究顯示，miR-22在宮頸癌中是一個抑癌因子，可以抑制癌細胞增殖和遷移并誘導其凋亡，是宮頸癌的候選治療靶標。HE等[13]研究顯示，miR-22-3p在非小細胞肺癌組織和細胞中表達顯著降低，可能為非小細胞肺癌提供潛在的生物標志物和治療靶標。本研究發現，肺腺癌腦轉移組患者腦脊液中miR-139、miR-22水平顯著低于肺腺癌無轉移組，提示miR-139、miR-22的異常表達參與肺腺癌腦轉移瘤的發生。

肺腺癌發生腦轉移的機制較為復雜，肺腺癌的N分期、M分期、TNM分期、近期療效可能是影響肺腺癌腦轉移的重要因素[14]。本研究發現，肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22水平與原發腫瘤數目、原發腫瘤分化程度、淋巴結轉移有關，提示miR-139、miR-22水平可能成為肺腺癌腦轉移的潛在生物標志物。miR-139、miR-22水平呈正相關，表明二者可能存在相互作用關系。SHAO等[15]研究報道，通過生物信息學方法分析非小細胞肺癌中miRNA與mRNA相互作用失調的網絡，預測miR-139-5p為診斷非小細胞肺腺癌的新型生物標志物。本研究發現，miR-139低表達、miR-22低表達是肺腺癌患者發生腦轉移瘤的危險因素，腦脊液中miR-139、miR-22對肺腺癌腦轉移瘤具有一定的診斷價值，二者聯合用于診斷的效果更好。此外，本研究中的細胞實驗結果說明miR-139、miR-22可通過調控肺腺癌細胞的侵襲和遷移影響腦轉移瘤的發生，進一步證實miR-139、miR-22對肺腺癌腦轉移瘤具有一定的診斷價值。

綜上所述，肺腺癌腦轉移瘤患者腦脊液中miR-139、miR-22均呈低表達，二者對肺腺癌腦轉移瘤均有一定的診斷價值。但本研究還有一些不足，如未對患者進行隨訪，還需擴大樣本量，進一步實施多中心的前瞻性試驗研究。