中藥復(fù)方對(duì)斷奶幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌混合型腹瀉的預(yù)防效果

吳 婕，蔣詩(shī)琪，黃 雨，夏耀輝，任東娜，馮世秀，任戰(zhàn)軍

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518004)

細(xì)菌性腹瀉是規(guī)?；B(yǎng)殖兔時(shí)的多見病[1]，其首要的致病菌為大腸桿菌、魏氏梭菌等兔場(chǎng)常見菌[2]，幼兔感染后發(fā)病迅速、癥狀危急，有極高病死率[3-4]。同時(shí)感染多種致病菌的腹瀉幼兔病情比單種致病菌型更嚴(yán)重、更難根治[5]。飼糧中添加中藥可有效防治兔腹瀉類疾?。很绮?、白頭翁、苦參、馬齒莧等主配的復(fù)方可防治兔大腸桿菌病[6]，白頭翁、生姜、石榴皮、甘草可用于初期治療兔魏氏梭菌型腹瀉[7]。本研究中的中藥復(fù)方含茜草、白頭翁、苦參、馬齒莧等均具抗菌消炎、提高免疫力等功效的藥材[8-18]，但其防治幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌型腹瀉的成效亟待考證。

本試驗(yàn)測(cè)定幼兔攝入含不同比例中藥復(fù)方的飼糧，遭遇攻毒后腹瀉率、免疫因子水平、盲腸菌群上的差異，探究該復(fù)方預(yù)防幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌型腹瀉的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

致病性大腸桿菌O1、兔致病A型魏氏梭菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

中藥復(fù)方由深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配伍并提供，組分為：茜草、白頭翁、苦參、馬齒莧、板藍(lán)根、蒲公英、大青葉、茯苓、蒼術(shù)、黃連、黃柏。

1.2 動(dòng)物處理

選擇體質(zhì)量相近、公母各半、健康無病的 (45±2)日齡伊拉幼兔32只，隨機(jī)分為對(duì)照組、攻毒組(Ⅰ)、0.5 % 中藥組(Ⅱ)、1.0 % 中藥組(Ⅲ)，每組8只，每只記為1重復(fù)。試驗(yàn)期第1～7 d，對(duì)照組、Ⅰ組幼兔提供基礎(chǔ)飼糧；Ⅱ、Ⅲ組分別在飼糧中添加0.5 %、1.0 %中藥復(fù)方。第8日施以攻毒：對(duì)照組腹腔注射8 mL生理鹽水，其余各組腹腔注射8 mL菌液(含大腸桿菌、魏氏梭菌各 4×109CFU)，各組飼糧不變。第14日處死存活幼兔，采集脾臟及盲腸內(nèi)容物。

1.3 盲腸菌群16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序

使用OMEGA E.Z.N.A.○RStoll DNA Kit提取幼兔盲腸菌群總DNA；委托諾禾致源公司，基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行16S rDNA V4區(qū)域的擴(kuò)增、構(gòu)建文庫(kù)及測(cè)序。去除原始讀取中的嵌合體及低質(zhì)量讀取，并以97%的一致性水平進(jìn)行OTUs聚類；進(jìn)行物種注釋及豐度分析以比較組間Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數(shù)與門屬優(yōu)勢(shì)菌群水平。

1.4 腹瀉率的測(cè)定

記錄各組攻毒后48 h內(nèi)的腹瀉情況。腹瀉率=總腹瀉天數(shù)/(8×總天數(shù))×100%。

1.5 免疫指標(biāo)的測(cè)定

參照兔sIgA、IgA、IgM、hs-CRP酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)步驟，檢測(cè)各組脾臟以上免疫因子的表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步記錄歸納；免疫因子水平通過SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)(ANOVA)，用LSD法進(jìn)行多重比較，并用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；其他數(shù)據(jù)使用組內(nèi)平均值 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥復(fù)方對(duì)幼兔腸道菌群的影響

2.1.1 α多樣性分析 由表1 可知，各組的凈讀數(shù)在79 586～80 678以內(nèi)，覆蓋度范圍在0.92～0.95，表明測(cè)序中對(duì)各試驗(yàn)組的檢測(cè)程度一致，并檢測(cè)出了絕大多數(shù)的序列；Ⅰ組的Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數(shù)普遍低于對(duì)照組，表明腹瀉幼兔腸道微生物物種的多樣性和豐富度低于健康幼兔；Ⅱ組的α多樣性指數(shù)均高于Ⅰ組，Ⅲ組的Shannon、Simpson指數(shù)高于Ⅰ組，表明中藥組幼兔腸道菌群的多樣性均高于腹瀉幼兔，且Ⅱ組的腸道菌群比Ⅲ組更豐富，體現(xiàn)出更好的治療效果。

表1 各處理中的測(cè)序信息及α多樣性指數(shù)Table 1 Information of sequencing and α diversity indices under different treatments

2.1.2 門屬水平優(yōu)勢(shì)菌群的組成與結(jié)構(gòu) 由表 2 可知，各組門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)為主，占盲腸微生物集落的82.97%～87.40%，這表明各組優(yōu)勢(shì)菌門的結(jié)構(gòu)與含量總體相近；Ⅰ組疣微菌門的相對(duì)水平顯著低于對(duì)照組和Ⅱ組(P<0.05)。各組屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群均為乳頭桿菌屬(Papillibacter)、Akkermansia屬、不明瘤胃菌科(unidentified_Ruminococcaceae)、不明腸桿菌科(unidentified_Enterobacteriaceae)、擬桿菌屬(Bacteroides)。在幼兔中，擬桿菌屬、Akkermansia屬是腸道有益菌群，不明腸桿菌科為有害菌群。與對(duì)照組相比，Ⅰ組Akkermansia屬的比例顯著降低(P<0.05)，不明腸桿菌科的相對(duì)含量上升(P>0.05)；Ⅱ組Akkermansia屬的相對(duì)豐度上升、不明腸桿菌科的豐度降低(P> 0.05)，擬桿菌屬的相對(duì)含量顯著上升 (P<0.05)。Ⅱ組Akkermansia屬、擬桿菌屬的比例均顯著高于Ⅰ組，不明腸桿菌科顯著低于Ⅰ組(P<0.05)；Ⅲ組優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度普遍處于Ⅰ、Ⅱ組之間的水平。Akkermansia屬是疣微菌門的主要菌群，門屬菌群水平的豐度分析揭示各組Akkermansia屬與疣微菌門一致的變化趨勢(shì)，同時(shí)表明Akkermansia屬對(duì)維持幼兔的腸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)、抵御病原體的侵襲有重要意義；Ⅱ組有效改善了有益菌、有害菌的相對(duì)水平，相比Ⅲ組更早恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)。

表2 腹瀉幼兔盲腸門水平與屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度差異Table 2 Differences in relative abundance of dominant cecum bacteria in diarrheal rabbits at levels of phylum and genus %

2.2 中藥復(fù)方對(duì)攻毒幼兔腹瀉率的影響

對(duì)照組在48 h內(nèi)無腹瀉幼兔，其余各組均有幼兔表征腹瀉。24 h內(nèi)，Ⅰ組腹瀉率為100%；Ⅱ、Ⅲ組腹瀉率均為25%；48 h內(nèi)，Ⅱ 組腹瀉率為31.25%，Ⅲ組腹瀉率為37.5%，表明中藥復(fù)方對(duì)幼兔大腸桿菌-魏氏梭菌混合腹瀉有顯著的預(yù)防效果。Ⅰ組幼兔在48 h內(nèi)均死亡；Ⅱ、Ⅲ組腹瀉幼兔分別在4、3 d內(nèi)死亡，表明該中藥復(fù)方對(duì)腹瀉幼兔的病情有一定的緩解作用。

2.3 中藥復(fù)方對(duì)腹瀉幼兔免疫指標(biāo)的影響

由表 3可知，Ⅱ組的IgM、SIgA、hs-CRP水平極顯著升高，Ⅲ組的IgM、IgA、SIgA、hs-CRP水平均極顯著升高(P<0.01)。此外，Ⅱ組的SIgA水平極顯著高于Ⅲ組(P<0.01)。該結(jié)果表明飼喂中藥可顯著提升幼兔的免疫能力。

表3 中藥提取物對(duì)試驗(yàn)組幼兔免疫因子的影響Table 3 Immune factors in experimental groups under different treatments of Chinese herbal medicine μg/mL

3 討 論

養(yǎng)殖戶預(yù)防幼兔腹瀉的措施常為接種各類疫苗，或飼喂抗生素，前者耗費(fèi)大量人力物力，后者易因長(zhǎng)期濫用抗生素使病菌的耐藥性提升，不利于養(yǎng)殖場(chǎng)的長(zhǎng)期防疫[19-20]。飼料添加劑“限抗禁抗”迫使人們尋求高效安全的抗生素替代物。本研究選取的中草藥均為本土常見藥材。中藥可通過改變腸道微生物比例達(dá)到治療目的，其機(jī)制可為防治幼兔細(xì)菌性腹瀉提供思路[21-22]。中藥復(fù)方的活性成分復(fù)雜，多為生物堿、酮類等化合物，味微苦，對(duì)動(dòng)物的適口性有一定影響，故在攻毒前有7 d的預(yù)飼期供幼兔適應(yīng)采食[23]。飼糧中添加0.5%、1%的中藥劑量在已有研究中證實(shí)對(duì)動(dòng)物采食量無顯著差異[23]；在本試驗(yàn)前7 d的預(yù)飼期中，0.5%、1%中藥組幼兔的采食量與對(duì)照組和攻毒組相比均無明顯變化，表明添加0.5%、1%水平中藥的飼糧適口性良好，不影響幼兔的充分采食。

3.1 中藥復(fù)方對(duì)幼兔腸道菌群的影響

盲腸菌群α多樣性指數(shù)反映腸道微生物的豐度、均勻度、復(fù)雜度等信息，其數(shù)值越高代表微生物類群的復(fù)雜度和多樣性越高、腸菌平衡越趨于穩(wěn)定[24]。健康動(dòng)物的腸道菌群α多樣性指數(shù)普遍高于患腸道疾病的動(dòng)物[25]。在本試驗(yàn)中，攻毒組腹瀉幼兔的α多樣性指數(shù)低于對(duì)照組健康幼兔，其腸道狀態(tài)與腹瀉幼兔相符；Ⅱ組的α多樣性指數(shù)與對(duì)照組持平，說明飼糧中添加0.5%中藥可更好地改善幼兔的腸道環(huán)境。

對(duì)照組的門屬水平均與前人研究中的幼兔盲腸微生物組成結(jié)構(gòu)相一致[26-27]。擬桿菌屬、Akkermansia屬是健康宿主腸道附殖的有益菌群：擬桿菌屬可分解膳食纖維中的阿拉伯木聚糖，增強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)；Akkermansia屬分解宿主腸道粘膜的粘蛋白，可調(diào)節(jié)宿主代謝，利于宿主抵御腸道炎癥[28-30]。不明腸桿菌科是宿主腸道中的有害菌群，腹瀉仔豬腸道菌群中不明腸桿菌科的比例上升[31-33]。在本試驗(yàn)中，腹瀉幼兔盲腸菌落中有益菌受抑制，有害菌過度增殖，加劇了腸道環(huán)境的失衡；而中藥通過調(diào)節(jié)攻毒幼兔腸道中有益菌和有害菌的比例，有效抵御致病菌的侵襲。

3.2 中藥復(fù)方對(duì)攻毒幼兔腹瀉率的影響

構(gòu)建動(dòng)物腹瀉模型可循肌肉注射、腹腔注射、口服灌注等攻毒手段[34]。腹腔注射菌液后的動(dòng)物病情發(fā)生較早、腹瀉程度偏重，與生產(chǎn)中幼兔急性腹瀉相似，故本試驗(yàn)結(jié)合已有文獻(xiàn)與預(yù)試驗(yàn)攻毒結(jié)果，選擇幼兔腹瀉率最高、攻毒后24 h內(nèi)無死亡的攻毒劑量建立大腸桿菌-魏氏梭菌腹瀉模型[6,34-35]。Ⅱ、Ⅲ組幼兔的腹瀉率遠(yuǎn)低于Ⅰ組，表明添加兩種比例的中藥均可有效預(yù)防腹瀉。

3.3 中藥復(fù)方對(duì)腹瀉幼兔免疫指標(biāo)的影響

IgM是機(jī)體防御病原體的第一批“衛(wèi)士”[36]。SIgA于機(jī)體胃腸道、呼吸道等粘膜表面有最高水平，可提升腸粘膜附殖微生物群落多樣性、抑制促炎菌群比例[37-40]。SIgA包被斷奶小鼠、牛、豬的胃腸道中近70%的共生菌群，增進(jìn)維持腸道菌群-腸粘膜的穩(wěn)態(tài)[41]。IgA缺陷小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂，對(duì)腸道共生菌群亦會(huì)產(chǎn)生全身性炎癥反應(yīng)[42]。Hs-CRP是炎性因子刺激時(shí)機(jī)體響應(yīng)的超敏C-反應(yīng)蛋白，常作為急性炎癥的標(biāo)記物[43]。本試驗(yàn)中Ⅱ、Ⅲ組的IgM、SIgA、Hs-CRP水平極顯著高于Ⅰ組，且Ⅱ組的SIgA水平極顯著高于Ⅲ組，說明飼糧中添加0.5%、1%的中藥可有效提升幼兔的免疫能力，且SIgA在兩菌混合感染幼兔的過程中起重要抵御作用。

4 結(jié) 論

混合感染大腸桿菌、魏氏梭菌的腹瀉幼兔盲腸微生物環(huán)境被破壞，有益菌的相對(duì)含量減少、有害菌的相對(duì)含量增加。0.5%水平的中藥復(fù)方可改善腸道菌群中有益菌與有害菌的水平，提高幼兔的免疫力，預(yù)防大腸桿菌-魏氏梭菌型腹瀉的效果更佳。