賀蘭山東麓‘蛇龍珠’葡萄病毒病種類鑒定及對采收期的影響

張強強，顧沛雯，張繼豐

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.寧夏西鴿酒莊有限公司，寧夏青銅峽 751100)

‘蛇龍珠’葡萄(Cabernet gernischt)是‘品麗珠’‘赤霞珠’等品種混合群體中，經過長期選育而成的一個釀酒葡萄品種[1]。其釀造的葡萄酒常帶有獨特的草本氣息，單寧質地柔軟，入口順滑，成為國內獨具代表性的紅色釀酒葡萄之一。該品種耐干旱，喜沙壤土質，在寧夏賀蘭山東麓和甘肅河西走廊種植表現良好，是寧夏主栽的紅色釀酒葡萄品種之一[2]。但是隨著寧夏葡萄種植面積的擴大，葡萄苗木引進和輸出日益頻繁，造成葡萄病毒病危害猖獗，研究發現賀蘭山東麓主要葡萄病毒病為卷葉病和扇葉病，‘蛇龍珠’感染病毒率最高，為85.1%[3-4]。

葡萄病毒種類繁多，迄今為止，從世界各地的葡萄上分離的病毒有86種[5]，國內報道有18種[6-14]，其中對卷葉伴隨病毒(Grapevine leafrool-associated virus，GLRaV)和葡萄扇葉病毒( Grapevine fanleaf virus，GFLV)研究最多。常用葡萄病毒的鑒定方法主要有指示植物鑒定法、酶聯免疫吸附測定法、逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測技術、分子雜交檢測方法、逆轉錄環介導恒溫擴增檢測技術和小RNA測序技術，目前我國己報道的葡萄病毒多采用RT-PCR方法確定[15]。呂苗苗等[4]利用5種葡萄卷葉伴隨病毒引物對寧夏賀蘭山東麓‘蛇龍珠’葡萄進行RT-PCR檢測，初步檢出3種卷葉病毒類型，其中GLRaV-3的檢出率最高，為87.5%；劉萬好等[16]通過小RNA測序鑒定出山東煙臺地區葉片反卷的‘蛇龍珠’攜帶有7種已知病毒和4種類病毒。‘蛇龍珠’葡萄復合侵染嚴重，但對感染病毒種類與癥狀類型的關系相關報道較少。

葡萄感染病毒后，會對葡萄的產量、生理機能和品質產生重大影響[5]。Andret-link等[17]發現葡萄扇葉病可導致植株節間縮短，顯著降低產量，癥狀嚴重時，損失可達80%以上。Endeshaw等[18]研究認為‘品麗珠’感染GLRaV-3后，降低了每藤新梢數、新梢生長和木質化程度。韓愛芹等[19]發現，感染卷葉病后葡萄果實的葡萄糖和果糖的總量僅為對照組的69.29%，5種花色苷單體含量顯著降低，總量僅為對照組總量的26.12%。目前有關葡萄病毒病的研究表明，病毒病會降低葡萄葉片中葉綠素含量及光合速率，減少總糖含量，提高酸度[16,19]。鑒于國內有關病毒病對‘蛇龍珠’葡萄品質和采收期的影響的研究較少。本研究以賀蘭山東麓樹齡超過20a的‘蛇龍珠’葡萄為材料，利用RT-PCR進行15種葡萄病毒的檢測，明確‘蛇龍珠’葡萄感染病毒的種類及造成危害的主要病毒，在此基礎上，通過測定罹病和無癥狀對照組‘蛇龍珠’葡萄的光合指標和果實理化指標，運用主成分分析法，評價不同采收時間對罹病和對照組‘蛇龍珠’葡萄果實成熟度、葡萄品質及采收期的影響，以期為該產區葡萄無毒化種植提供依據，也為準確把握‘蛇龍珠’葡萄最佳采收期提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

2020 年8月于寧夏西鴿酒莊葡萄園中，從感染病毒病和外觀正常的‘蛇龍珠’葡萄樹上采集葉片和果實，罹病葡萄選取標準：葉片反卷、發紅，出現扇葉化癥狀；無癥狀對照組葡萄選取標準：葡萄植株正常，葉片無卷葉、發紅、扇葉化癥狀，生長期保持綠色平整狀態。

1.2 方 法

1.2.1 采樣 在‘蛇龍珠’葡萄完成轉色后(2020年8月15日)進行采樣，每次采樣分別選取5棵罹病和對照組葡萄樹，每棵樹按上、中、下部位隨機采集3穗葡萄和3片葡萄葉，共采樣5次，采樣日期分別為8月15日、8月28日、9月8日、9月20日和9月27日。以同一樹體的3片葡萄葉為1個樣品，用錫箔紙包好后迅速放入液氮罐中，罹病和對照組各25份樣品，存于-80 ℃冰箱備用，用于葡萄病毒檢測；采集的葡萄果穗放入冰盒帶回實驗室，取一部分鮮樣用4 層紗布擠汁待用，用于還原糖、滴定酸、pH和可溶性固形物的測定；將剩余樣品經液氮迅速冷凍，使用研磨打樣機(SL-200)將果實樣品粉碎，-80 ℃冰箱貯存備用，用于總酚、單寧和花青素的測定。

1.2.2 RT-PCR檢測 根據文獻[4,14]設計15種葡萄病毒病的特異性引物，引物序列見表1。

將采集的葡萄葉片加入液氮迅速研磨至粉末狀，取100 mg至1.5 mL的離心管中，按照OMEGA 植物RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)使用說明書進行總RNA的提取。提取出的總RNA采用反轉錄試劑盒(北京全式金生物有限公司)說明書反轉錄成cDNA，采用設計的特異性引物對樣品中病毒進行檢測，每個樣品重復3次。

PCR擴增反應體系50 μL：cDNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，MaxTaq酶25 μL，RNase-free Water 18 μL；PCR擴增條件：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 1 min，退火45 s，退火溫度見表1，72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃ 10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 用于RT-PCR檢測的15種葡萄病毒引物Table 1 Primers of 15 grapevine viruses for RT-PCR detection

1.2.3 測定項目及方法 采用葉綠素計(SPAD-502型)測定SPAD值；采用便攜式光合儀(GFS-3000型，德國)測定凈光合速率、蒸騰速率、葉片氣孔導度、胞間二氧化碳濃度；采用斐林試劑滴定法(GB/T 15038-2006)測定還原糖；采用酸堿滴定法(GB/T 15038-2006)測定滴定酸(以酒石酸計)；采用pH 計(PHS-3C，上海)測定葡萄汁pH；采用手持糖度計(ATAGOPAL-1，上海)測定其可溶性固形物含量；采用Folin-Denis(福林丹尼斯)試劑顯色法[20]測定單寧含量；采用Folin-Ciocalteu(福林酚)試劑顯色法[21]測定總酚；采用pH 示差法[22]測定總花青素；采用稱量法測定百粒質量，每個樣品測定3次。

1.2.4 統計分析樣本間差異 采用Microsoft Excel 2010對數據進行整理，采用SPSS 21.0鄧肯氏多重比較進行顯著性分析，采用Origin 2018進行主成分分析及制圖，得出主成分函數方程式，計算不同采收時期綜合得分，確定最佳采收期。

2 結果與分析

2.1 ‘蛇龍珠’葡萄病毒病田間發病癥狀

如圖1所示，‘蛇龍珠’葡萄植株感染病毒病后，絕大多數表現為卷葉癥狀。感染病毒初期，葉片輕微向后翻卷，葉脈黃綠色，葉片保持綠色(圖1-a)；之后葉片逐漸出現紅色或紫紅斑點(圖1-b)；隨著葉片生長，紅色斑點逐漸變大成為紫紅色不規則肉斑(圖1-c)，直至整個葉片變紫紅，透過陽光看呈鮮紅色，葉脈黃綠色，葉片反卷(圖1-d)，后期葡萄中部和底部葉片反卷變紅，變厚變脆(圖1-e)。

在田間‘蛇龍珠’葡萄感染病毒后期表現4種癥狀，Ⅰ型：葉片反卷，葉緣銳呈不規則鋸齒狀，葉肉紫紅色(圖1-f)；Ⅱ型：葉片發紅，葉脈黃色，葉片反卷明顯，葉脈間有黑色斑塊(圖1-g)；Ⅲ型：葉片未發生反卷，葉脈黃綠色，葉脈間有紅色斑塊(圖1-h)；Ⅳ型：葉片反卷，葉脈為黃綠色，正反看葉脈間都有紫黑色肉斑(圖1-i)。

圖1 ‘蛇龍珠’葡萄病毒病田間癥狀Fig.1 Field symptoms of virus disease in ‘Cabernet Gernischt’ grape

此外，前期在‘蛇龍珠’葉片上還發現兩種類似扇葉病癥狀，如圖2所示。一種為扇形葉或畸形葉：葉片皺縮畸形，葉緣缺刻深，缺口深達主脈，葉脈不對稱、扭曲、明脈，葉緣鋸齒銳呈不規則狀，葉柄洼開角大，主脈聚近，呈扇葉狀(圖2-a)。另一種為花葉形：葉片上分布有許多邊緣不清、形狀不規則的黃色斑點或斑塊，顏色濃淡不同，呈環狀線紋、褪綠環狀圓或不規則形(圖2-b)。

a.扇形葉癥狀; b.花葉形癥狀a. Symptoms of grapevine fan leaf type; b. Symptoms of grapevine mosaic type

2.2 ‘蛇龍珠’葡萄病毒種類鑒定

利用15種病毒引物，對采集的罹病和對照組共50份田間樣品進行RT-PCR檢測，并對擴增產物進行凝膠電泳和測序分析，結果如表2和圖3所示，罹病樣品均檢測到病毒，共有8種葡萄病毒，分別是GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GFLV、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV；對照組樣品檢測到3種病毒，分別是GRSPaV、GVA和GINV，其中GLRaV-3的檢出率最高，達 50.00%，其次為GRSPaV和GINV，檢出率分別為42.00%和46.00%，GFLV的檢出率最少，僅為4.00%。

表2 RT-PCR檢測結果Table 2 Sequencing results of RT-PCR products

M.Marker；1.GLRaV-1；2.GLRaV-2；3.GLRaV-3； 4.GFLV；5.GRSPaV；6.GVA；7. GPGV；8.GINV

針對上述‘蛇龍珠’葡萄感染病毒后的4種后期癥狀類型(圖1-f～i)分別進行RT-PCR檢測發現，Ⅰ型癥狀檢測到GLRaV-3、GFLV、GRSPaV和GPGV；Ⅱ型癥狀檢測到GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV；Ⅲ型癥狀檢測到GLRaV-3、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV；Ⅳ型癥狀檢測到GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GFLV、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV。說明‘蛇龍珠’葡萄病毒病復合侵染嚴重，感染的病毒種類不同，其癥狀表現也不同。

2.3 病毒感染對‘蛇龍珠’葡萄光合指標的影響

由表3可知，與對照相比，罹病葡萄的葉片氣孔導度和光合速率顯著降低(P<0.05)，葉片氣孔導度降幅為37.77%，凈光合速率降幅為 17.21%；罹病葡萄的SPAD值極顯著降低(P< 0.01)，降幅為14.89%。說明病毒感染導致葡萄光合作用減弱。

表3 病毒感染的‘蛇龍珠’葡萄光合指標Table 3 Photosynthetic index of ’Cabernet Gernischet’ grape under virus infection

2.4 病毒感染對‘蛇龍珠’葡萄果實品質的影響

如表4所示，罹病葡萄果實各成分的累積動態與對照組葡萄基本一致，pH、可溶性固形物、還原糖、百粒質量、花青素、總酚、糖酸比、固酸比隨果實成熟總體呈現增加趨勢，可滴定酸和單寧隨果實成熟總體呈現下降趨勢。

表4 ‘蛇龍珠’葡萄果實各理化指標檢測結果Table 4 Testing results of physical and chemical indicators in ‘Cabernet Gernischt’

對比5次采樣測定結果，在8月15日和8月28日罹病葡萄果實各成分含量與對照相當。自9月8日第3次采樣一直到成熟采收，罹病葡萄果實各成分含量逐漸與對照形成差異，其中在9月20日差異最大。與對照相比，罹病葡萄的可溶性固形物含量呈極顯著下降(P<0.01)，在9月20日降幅最大，為19.36%；罹病葡萄還原糖含量、糖酸比和固酸比在9月20日與對照差別達到極顯著水平(P<0.01)，降幅最明顯，還原糖含量降幅為18.09%，糖酸比降幅為25.24%，固酸比降幅為27.44%；罹病葡萄的可滴定酸含量在9月20日與對照相比呈顯著增加(P<0.05)，增幅為 15.94%；罹病葡萄的pH和百粒質量在9月20日采樣測定結果，與對照相比顯著降低(P< 0.05)，pH降低1.83%，百粒質量降低9.51%；罹病葡萄的花青素、總酚和單寧含量與對照相比有所降低，但無顯著差異。

表5 主成分方差分析Table 5 Analysis of variance of principal components

2.5 ‘蛇龍珠’葡萄適宜采收期的主成分分析

針對罹病和對照組葡萄的10 個果實品質指標5 批樣品分別進行主成分分析，由表5可知，按主成分提取特征值需大于1的原則，罹病和對照組葡萄各提取2個有效主成分，其累計方差貢獻率分別為74.028%和72.833%，具有一定的代表性，可進行進一步分析。

如圖4主成分載荷圖所示，罹病和對照組葡萄的PC1 都與pH、可溶性固形物、還原糖、百粒質量、糖酸比、固酸比具有較好的相關性，解釋了這6 個變量在確定最佳采收期時所起到的作用，且主要都是反映葡萄漿果本身品質的指標；PC2 與總酚、單寧具有較好的相關性，解釋了這2個變量在確定最佳采收期時所起到的作用，且主要都是反映葡萄漿果在釀造過程中較為重要的品質指標。

a.罹病葡萄的載荷圖;b.對照組葡萄的載荷圖a.Load diagram of infected grapes;b.Load diagram of CK

根據主成分分析得到的成分矩陣，計算特征向量矩陣，將所提取出的主成分分別表示為各變量的線性組合，得到主成分的函數方程式(1)～(4)。方程式(1)和方程式(2)為罹病葡萄兩個主成分的函數方程，方程式(3)和方程式(4)為對照組葡萄兩個主成分的函數方程。方程式中X1～X10分別代表pH、可溶性固形物、還原糖、可滴定酸、百粒質量、花青素、總酚、單寧、糖酸比、固 酸比。

F1=0.343X1+0.343X2+0.334X3- 0.340X4+0.335X5+0.230X6+0.240X7- 0.177X8+0.377X9+0.376X10

(1)

F2=-0.101X1-0.114X2+0.212X3- 0.056X4-0.158X5-0.159X6+0.558X7+ 0.715X8+0.161X9+0.059X10

(2)

F1=0.356X1+0.363X2+0.360X3- 0.336X4+0.273X5+0.214X6+0.218X7- 0.212X8+0.380X9+0.378X10

(3)

F2=-0.031X1-0.068X2+0.010X3- 0.148X4-0.094X5-0.383X6+0.650X7+ 0.612X8+0.110X9+0.095X10

(4)

F=0.838F1+0.162F2

(5)

F=0.861F1+0.139F2

(6)

對所有變量進行標準化處理，計算各個采收期所對應的F1和F2的得分，以F1和F2各自的特征值作為權重，進行加權處理，得到各個采收期的綜合得分方程F，方程(5)和方程(6)分別為罹病和對照組葡萄不同采收期綜合值F函數方程，并根據F值的大小對不同采收期‘蛇龍珠’葡萄的整體品質情況進行排名。綜合得分越高，排名越靠前，說明該時期的葡萄品質越好，從而確定最佳采收期[23]。

從表6 可以看出，罹病葡萄品質綜合排名在2020-09-27最高，對照組葡萄在2020-09-20最高，因此得出該年度該地區罹病‘蛇龍珠’葡萄的最佳采收期為9月27日，對照組的最佳采收期為9月20日，對比發現感染病毒后，葡萄的最佳采收期比健康植株晚了1周。

表6 在病毒感染下對‘蛇龍珠’葡萄不同采收期品質綜合評價Table 6 Comprehensive evaluation of grape quality at different harvest time of ‘Cabernet Gernischet’ grape under virus infection

3 討 論

目前國內各葡萄產區葡萄病毒復合侵染嚴重。范旭東等[14]采用小RNA測序技術從 ‘陽光玫瑰’葡萄樣品測定到8 種病毒，其葉片呈現褪綠斑駁、畸形、小葉、反卷等癥狀；李晨等[24]研究發現在‘陽光玫瑰’‘巨峰’和‘玫瑰香’上存在2 種及以上葡萄病毒復合侵染的現象。本研究通過RT-PCR方法檢測出賀蘭山東麓地區‘蛇龍珠’感染了8種葡萄病毒，分別是GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GFLV、GRSPaV、GVA、GPGV、GINV，其中GINV在‘蛇龍珠’葡萄上為首次報道。此外，通過田間觀察與RT-PCR檢測發現‘蛇龍珠’葡萄感染病毒種類不同，所表現出的癥狀也不同，有些病毒在田間并不顯示癥狀，存在潛伏侵染，應該引起相關部門對葡萄苗木繁育安全性的重視。

徐美隆等[25]研究發現葡萄感染病毒后，其SPAD值、葉片氣孔導度和光合速率顯著降低，本研究與其結果一致。對品質來說，同一采收時間，罹病葡萄的pH、可溶性固形物、還原糖、花青素、總酚、單寧含量與對照相比顯著減少，可滴定酸含量增加，這與劉萬好等[16]、于素珍等[26]有關葡萄卷葉病對果實品質影響的結果一致。葡萄酒釀造的最佳糖酸比為35～45，糖酸比太高或太低都會影響葡萄酒的口感[27]。賀蘭山東麓產區由于晝夜溫差大，健康的‘蛇龍珠’葡萄的糖度太高，酸度不足，釀造的葡萄酒結構性較差，表現出口感寡淡，而‘蛇龍珠’葡萄感染病毒病后，其酸度會增加，反而有利于釀酒葡萄達到最佳糖酸比。但考慮到葡萄一旦感染葡萄病毒，即終身帶毒，病毒會逐年積累且通過苗木、接穗傳播，對葡萄產業長久發展不利。因此，生產上必須加強葡萄苗木脫毒，促進產業健康發展。

傳統的葡萄最佳采收期僅通過測量果實含糖量、含酸量和果粒質量等指標來確定，忽略了酚類物質等其他重要參數對葡萄品質的影響，而利用主成分分析則能全面客觀地確定葡萄最佳采收期[28]。本研究利用主成分分析發現罹病葡萄的最佳采收期比對照組葡萄晚了1周，這與Montero等[29]研究發現葡萄感染GLRaV-3延緩了葡萄的成熟結果一致，進一步驗證了葡萄病毒感染會延遲葡萄漿果成熟。

寧夏賀蘭山東麓‘蛇龍珠’葡萄感染8種葡萄病毒，復合侵染嚴重，葡萄感染病毒病后，降低光合作用，影響果實成熟，造成葡萄采收時間的推遲。對于光熱充足、栽培規模較大的葡萄產地，可通過延后采收，降低葡萄病毒病的影響。鑒于葡萄病毒病尚無有效藥劑進行防治，生產中還應選用脫毒苗木，避免葡萄病毒病大肆傳播。