不同支氣管鏡采樣方式聯(lián)合二代測(cè)序在重癥肺炎并機(jī)械通氣患者病原診斷中的應(yīng)用

李耀軍，李琳

（河南省漯河市中心醫(yī)院 呼吸與危重癥科，河南 漯河 462000）

重癥肺炎已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，肺部感染病原學(xué)的診斷和敏感藥物的選擇是重癥肺炎患者治療的關(guān)鍵問題。目前常用的微生物學(xué)檢測(cè)方法如涂片、病原微生物的培養(yǎng)及聚合酶鏈反應(yīng)已不能滿足臨床需求［1］。近年來，基因組分析二代測(cè)序技術(shù)（mNGS）不斷成熟及普及，為病原學(xué)診斷提供了一種新的有力手段，mNGS效能較傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)技術(shù)更強(qiáng)大［2］，但也有一定的局限性，還需要進(jìn)行更多的臨床探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年6月我院RICU收治的40例重癥肺炎并機(jī)械通氣患者，其中男性23例，女性17例；年齡21～83歲，平均年齡（49.23±9.31）歲。

1.2 方法

1.2.1 取樣及傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè) 由同一醫(yī)護(hù)團(tuán)隊(duì)對(duì)入組患者進(jìn)行樣本取樣，取樣方式包括保護(hù)性毛刷（PSB）取樣、常規(guī)支氣管肺泡灌洗（BALF）取樣、支氣管鏡吸取（ETA）取樣。取樣結(jié)束后均進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌、真菌、抗酸涂片及培養(yǎng)。痰定量培養(yǎng)的細(xì)菌濃度≥107cfu／mL，經(jīng)BALF培養(yǎng)的細(xì)菌濃度≥104cfu／mL，經(jīng)ETA細(xì)菌培養(yǎng)的濃度≥105cfu／mL，經(jīng)PSB所取樣本后培養(yǎng)的細(xì)菌濃度≥103cfu／mL時(shí)為致病菌的可能性較大。

1.2.2 mNGS檢測(cè) ①DNA提取：取0.5～3 mL痰液，混合震蕩后依據(jù)試劑盒步驟提取DNA。②文庫構(gòu)建和測(cè)序：質(zhì)控文庫片段大小，質(zhì)控分析DNA文庫的濃度，環(huán)化后形成單鏈的環(huán)形結(jié)構(gòu)。文庫環(huán)化后再通過滾環(huán)復(fù)制后生成DNA納米球（DNB），將其加載到測(cè)序芯片，通過illumina Hiseq2500／MiSeq測(cè)序。③數(shù)據(jù)分析：通過比對(duì)，將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對(duì)上人參考基因序列部分去除，再去除剩下數(shù)據(jù)中的低復(fù)雜度部分，然后再與專用微生物大數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，最后將比對(duì)后數(shù)據(jù)按照細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲進(jìn)行分類與排列。依據(jù)檢出毒力基因、耐藥基因的信息應(yīng)用抗菌藥物治療。

1.3 觀察指標(biāo)參考《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南》［3］對(duì)病原體的診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算不同取樣方式病原體檢測(cè)的陽性率、敏感度、特異度、準(zhǔn)確率。診斷標(biāo)準(zhǔn)：在臨床診斷基礎(chǔ)上，若同時(shí)滿足以下任一項(xiàng)即可作為致病菌確定的依據(jù)。①在合格的下呼吸道分泌物中上皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞數(shù)的比值小于2∶5（每個(gè)低倍視野中上皮細(xì)胞＜10個(gè)，中性粒細(xì)胞數(shù)＞25個(gè)），患者的臨床表現(xiàn)典型且經(jīng)PSB、BALF、肺組織或無菌體液培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)了病原菌。②在組織損害基礎(chǔ)上加上在直接鏡檢、細(xì)胞病理學(xué)或肺組織標(biāo)本的病理學(xué)檢測(cè)中找到真菌。③病毒血清中的IgM抗體由陰轉(zhuǎn)陽、肺不典型病原體或急性期和恢復(fù)期雙份血清特異性IgG抗體滴度的變化≥4倍。計(jì)算公式：陽性率＝陽性例數(shù)／總例數(shù)×100%；敏感度＝真陽例數(shù)／（真陽例數(shù)＋假陰例數(shù)）×100%；特異度＝真陰例數(shù)／（真陰例數(shù)＋假陽例數(shù)）×100%；準(zhǔn)確率＝真陽例數(shù)／（總例數(shù)－真陰例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSB＋mNGS檢測(cè)病原體的診斷效能比較PSB＋mNGS檢測(cè)病原體的陽性率、敏感度、特異度均高于PSB＋傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè) （P＜0.05）。見表1。

表1 PSB＋mNGS檢測(cè)病原體的診斷效能比較

2.2 BALF＋mNGS檢 測(cè) 病 原 體 的 診 斷 效 能 比 較BALF＋mNGS檢測(cè)病原體的陽性率、敏感度、特異度均高于BALF＋傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)（P＜0.05）。見表2。

表2 BALF＋mNGS檢測(cè)病原體的診斷效能比較

2.3 ETA＋mNGS檢測(cè)病原體的診斷效能比較ETA＋mNGS檢測(cè)病原體的陽性率、敏感度、特異度均高于ETA＋傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè) （P＜0.05）。見表3。

表3 ETA＋mNGS檢測(cè)病原體的診斷效能比較

2.4 不同支氣管鏡采樣方式聯(lián)合mNGS對(duì)病原體的診斷效能比較PSB＋mNGS、BALF＋mNGS、ETA＋mNGS檢測(cè)病原體的陽性率（100.00% vs.95.00% vs.100.00%）、敏感度（90.00%vs.95.00% vs.95.00%）、 特 異 度 （95.00% vs.85.00% vs.90.00%）及準(zhǔn)確率（100.00% vs.100.00% vs.100.00%）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

重癥肺炎的病程發(fā)展迅速，可由局部感染迅速進(jìn)展到全身感染，有時(shí)還會(huì)伴有嚴(yán)重的膿毒癥［4］。近年來，隨著mNGS技術(shù)不斷成熟及普及，為病原學(xué)的診斷提供了一種新的診斷手段。與傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)技術(shù)相比，mNGS具有更強(qiáng)大的效能，但也存在一定的局限性。

本研究結(jié)果顯示，PSB、BALF與ETA采樣后mNGS檢測(cè)的陽性率、敏感度及特異度均高于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)（P＜0.05），提示mNGS對(duì)病原微生物的檢測(cè)效能優(yōu)于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)，與Long等［5］的研究結(jié)果一致。分析其原因可能為：mNGS不僅能直接檢測(cè)所提取標(biāo)本中的全部核酸片段，在通過生物信息學(xué)分析法鑒定出標(biāo)本中所含核酸種類的同時(shí)，還能獲得病原體的序列數(shù)及覆蓋度等定量分析的數(shù)據(jù)；另外，mNGS檢測(cè)前所用的標(biāo)本不需要進(jìn)行培養(yǎng)，不僅可避免難以培養(yǎng)的病原體漏檢，檢測(cè)時(shí)還能直接非特異性地測(cè)定出全部核酸片段，無需提前選定檢測(cè)范圍，最大限度地從根源上避免了病原體的漏檢。因此，與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)相比，mNGS病原檢測(cè)的特異度、陽性率及敏感度均明顯提高。本研究結(jié)果還顯示，PSB＋mNGS、BALF＋mNGS、ETA＋mNGS檢測(cè)病原體的陽性率、敏感度、特異度 及準(zhǔn)確 性比較 差異無 統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義 （P＞0.05），表 明mNGS對(duì)病原微生物的檢測(cè)效能不受采樣方式的限制。

綜上所述，與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)相比，mNGS對(duì)病原體診斷效能更好，臨床上應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)牟蓸臃绞竭M(jìn)行mNGS檢測(cè)，對(duì)重癥肺炎患者的診治具有重要的意義。