雞球蟲病活疫苗實驗室安全性試驗

呂寧寧，王宗升，馬冬，邵三敏，許榮強，牛營，賈鑫玉

（青島易邦生物工程有限公司 山東青島 266113）

隨著生活水平不斷提高，雞肉的品質也被大眾所要求。家禽飼養周期短，投資成本比較小，深受廣大畜牧行業投資者的喜歡。我國雞品種種類豐富多樣，雞肉脂肪含量少，肉質鮮美，深受大眾喜歡。近幾年經濟不斷地發展，規模化養殖場越來越多，伴隨著養殖場的雞球蟲病也越來越多，幾乎所有養殖場深受球蟲病的危害。球蟲病已經給養殖場造成多達幾十億的損失。隨著科研水平不斷進步提高，雞球蟲活疫苗的開發研究越來越多，可以有效解決家禽動物的耐藥性問題并且能夠改善雞的肌肉品質和蛋品質，對人們來說可以減少藥物殘留食用的危害。目前市面上球蟲病的疫苗基本可以控制場內雞球蟲病的侵害，但不能完全有效的控制。雞球蟲種類較多，會出現疫苗不對型，導致球蟲病無法控制。雞球蟲活疫苗從上市至今銷售量一直在增長，僅Coccivac 和Immucox 在10 年之間共銷售了上百億頭份[1]。本文主要對雞球蟲活疫苗的研究進展以及球蟲疫苗實驗室安全性試驗評價等方面進行概述。

1 雞球蟲病研究進展

1.1 雞球蟲病

1）雞球蟲生物學特性及分類。

雞球蟲屬于艾美耳屬，有四個孢子囊，八個子孢子。球蟲的生活史可分三個階段：孢子生殖（sporogony）在宿主體外，裂殖生殖（merogony）、配子生殖（gametogony）在宿主體內[2]。Sporogony 生殖需要在濕潤、有氧的條件下發育形成卵囊，未形成卵囊的孢子不具有傳染性。Merogony 生殖主要是家禽在采食吸入到消化道，通過胃內容物碾磨、胃溶液、膽汁等消化釋放出子孢子，從而入侵到腸道上皮細胞進行裂殖。Gametogony 生殖又叫有性生殖，裂殖子發育形成小配子體，小配子與大配子結合形成合子，發育形成卵囊，最終排出腸道。

全世界公布雞球蟲種類有14 種以上，我國大概有7 種，其中柔嫩艾美耳球蟲（eimeria tenella）、毒害艾美耳球蟲（eimeria necatrix）、巨型艾美耳球蟲（eimeria maxima）在我國占據較多[3]。該寄生蟲主要通過糞口傳播感染雞，傳染源主要有水、糞便、食物等。

2）雞球蟲病流行病學。

雞球蟲病是我國第二類動物疫病，主要寄居在雞腸道內的一種寄生蟲病。雞球蟲病廣泛分布于全球。發病不分季節、日齡段，各個日齡段均可發病，所有日齡均易感。雞場內發病率高達50%，死亡率20%以上。迄今為止，大部分養殖戶還是在用抗生素進行球蟲治療，導致球蟲病耐藥性越來越嚴重。

雞球蟲容易適宜外界環境，球蟲卵具有堅硬且密度大的卵囊壁，可以在糞便和土壤中存在很長時間。常見的消毒劑（84 消毒液、75%酒精）常規配比無法殺死球蟲，10%的氨水、燒堿等可以殺死球蟲，40 ℃以上可以殺死蟲卵，在干燥不潮濕的地方球蟲不易生長。最常見的柔嫩艾美耳球蟲主要寄生于在30 日齡左右雞，急性聚集性暴發致死率可達100%。巨型艾美耳球蟲主要發病于蛋雞和大日齡雞，致死率不高。

3）雞球蟲病免疫機制。

感染雞球蟲病的主要臨床特征是精神沉郁、消瘦、蛋雞產蛋率下降、血痢、死亡等。解剖觀察發現內臟腸道彌散性出血、盲腸腫大充血，嚴重時小腸發黑壞死。一般感染7 天后癥狀明顯。不同種類的球蟲對應不同的抗原，其中巨型艾美耳球蟲的抗原性最強。機體感染后主要激發機體產生細胞免疫，抵抗球蟲對機體的侵害。

T 細胞介導機體產生細胞免疫應答，促進淋巴細胞分泌淋巴因子，通過吞噬細胞、NK 細胞阻止寄生蟲入侵，吞噬細胞可以非特異性的吞噬子孢子和裂殖子并且參與機體免疫防御機制，做出免疫應答。體液免疫主要是通過機體產生抗體，與抗原發生中和，從而抵抗入侵。體液免疫產生IgA、IgM 和IgG，最先抵御寄生蟲入侵的是IgM 但無記憶功能。當臨床癥狀比較明顯時，IgG 抗體也開始出現，第14 天抗體達到高峰，之后開始下降，IgG 抗體有較強的免疫記憶功能。

1.2 雞球蟲病疫苗

雞球蟲活疫苗研究非常廣泛，目前有強毒活苗、弱毒活苗、基因亞單位疫苗和核酸DNA 疫苗。強毒活苗是自然收集蟲卵從糞便和腸道中，然后培養、純化所需的種類，按照不同球蟲比例混合制成。強毒苗的缺點在于采食量降低、飼料轉化率的降低，從而影響雞的生長速度。弱毒活苗可以通過冷卻、加熱、輻射、化學誘導劑等物理化學的方法對蟲卵進行弱化，還有可以通過雞胚連續傳代獲得致病性低的活疫苗。弱毒活疫苗的缺點是傳達多次后毒力恢復，遺傳穩定性差。

DNA 疫苗是通過篩選出球蟲的抗原基因插入到所表達的宿主載體中，構建重組表達質粒，注射到動物體內，從而刺激機體產生免疫應答。用E.tenella 的PET-TA4 重組蛋白表達的活菌免疫雞只，攻毒后免疫組的RWG 高于對照組、卵囊產量明顯低于攻毒組。DNA 疫苗自身免疫安全，制備高效簡單，缺點是可能出現基因突變與免疫耐受等。基因亞單位疫苗是去除抗原中有害基因，只保留其抗原性，進行母源免疫獲得抗體。亞單位疫苗可以通過肌肉免疫激發機體產生抗體。

2 雞球蟲病活疫苗安全性試驗

2.1 試驗方法

運用一次單劑量接種試驗、單劑量重復接種試驗和一次超劑量接種試驗三種類型進行實驗，并設立空白對照組。注射疫苗種類方式、飼養方式、飼料品種、雞品種健康狀況嚴格執行一致。不同組別分開飼養，按規定時間進行接種。按照中國農業農村部頒發的《獸用生物制品實驗室安全試驗技術指導原則》進行安全性檢測，為該疫苗的臨床應用提供依據。

單劑量接種試驗一般是在雛雞出生4 d 后接種一次，計量按照疫苗說明書最適量進行注射，接種后每天觀察雞情況并記錄并且在第7 天和第14 天進行稱重、剖檢。單劑量重復接種試驗是在雛雞出生4 d 后接種第一次，間隔14 d 后接種第二次，接種后每天觀察雞情況并記錄并且在第7 天和第14 天進行稱重、剖檢。一次超劑量接種試驗是按照疫苗說明書最適劑量的10 倍、20 倍、40 倍、100 倍進行接種，接種后每天觀察雞情況并記錄并且在第7 天和第14 天進行稱重、剖檢。

2.2 安全性效果評價指標

雞球蟲疫苗接種開始后，每日對雞的精神狀況、采食情況、接種部位情況、呼吸情況、糞便收集、雞死亡情況等進行觀察并記錄。對試驗期間雞的體重和體溫進行記錄。接種后第7 天和14 天進行剖檢，對內臟器官（心、肝、脾、肺、腎、腸道）、免疫器官（法氏囊）、注射部位的肌肉進行物理方法肉眼觀察。并取十二指腸、空腸、回腸、盲腸等相對應的內臟組織進行切片染色觀察（10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察）。測定實驗雞的生長性能以及肌肉品質性狀。

2.3 雞球蟲病疫苗安全性評價結果

一次單劑量接種試驗雞群表現正常，雞群不會出現死亡、體重下降現象。剖檢腸道病少見，一般會出現腸道增生出血，十二指腸個別會出現少量白色結節，盲腸極個別會出血；腸道黏膜內能夠找到少量球蟲；其余器官未發生病變，在器官中未找到球蟲以及蟲卵[4]。與空白對照組相比較無差異。在對腸道組織進行石蠟切片、包埋、HE 染色、顯微鏡下染色鏡檢觀察，并未發現腸道黏膜脫落，腸道正常，其余器官組織也無明顯病變。表明一次單劑量接種對雞無異常情況表現，對雞安全。

單劑量重復接種試驗在實驗過程中雞群表現正常，一般也不會出現死亡。第二次接種7 天后剖檢觀察，十二指腸出現少量白色結節、空腸脹氣、盲腸有出血點，其余器官組織無明顯可見病變。顯微鏡下觀察發現，十二指腸出現黏膜斷裂、脫落，腸道內出現大量的蟲體，并在小腸內黏膜固有層看到蟲體和蟲卵。表明單劑量重復接種對雞無異常情況表現，無肉眼可見病變，對雞安全。

一次超劑量接種試驗在實驗中，100 倍超劑量接種后第二天就出現精神沉郁、采食量下降，一周出現死亡。其余倍數劑量無明顯癥狀，鏡檢下觀察十二指腸黏膜嚴重脫落，出現大量白色結節，腸黏膜出血。黏膜固有層出現大量球蟲和蟲卵，并有淋巴細胞和嗜酸性粒細胞出現。個別雞出現肝臟腫大、心肌纖維腫大、腎小管腫大壞死，采食量與日增重均下降。一次超劑量接種對雞出現肉眼可見生理反應，出現臨床癥狀，同時機體出現防御抵抗炎癥反應的嗜酸性淋巴細胞。

3 討論

安全性實驗旨在評價疫苗的安全使用性，為生產臨床提供基礎評價指標。目前市面上出現的雞球蟲病三價活疫苗（柔嫩+毒害+巨型艾美耳球蟲三種）、雞球蟲病四價活疫苗（柔嫩+堆型+巨型+毒害艾美耳球蟲四種），通過分離、純化、培養、弱化后得到疫苗。

雞球蟲的免疫抗體水平在一定條件下會隨著接種雞球蟲活疫苗的劑量而增加[5]。球蟲抗體水平隨著時間的延長而降低，二次免疫會再次激發機體的免疫記憶，提升機體的抗體水平且持續時間長。選擇小日齡接種雞球蟲疫苗，由于幼禽免疫系統發育不夠完善，不能夠產生足夠的抵抗能力。選擇大日齡的雞，不能夠在球蟲高發期機體獲得高水平抗體水平，導致雞場球蟲大面積暴發。王麗[6]研究結果顯示，Eimeria Tenella 和Eimeria acervulina 活疫苗株兩次免疫間隔時間為7～11 d，雛雞能夠獲得很好的抗體免疫力。■