孕酮對鯽魚胚胎發育和內分泌干擾效應

王晨， 滿曉婷， 王穎， 張云紫， 周新雨， 萬汝燕， 夏曉華

（河南師范大學生命科學學院，河南新鄉453007）

內分泌干擾物是一類激素類環境污染物，類固醇激素被認為是內分泌干擾物中最活躍的藥物類別之一，極少量殘留即可影響水生脊椎動物的繁殖和發育。作為一類重要的類固醇激素，孕激素具有調節內分泌與生殖周期的功能。孕酮（P4）是一種典型的孕激素，它被廣泛用于人類激素替代療法、避孕藥的制作和其他醫療應用（Lianget al.，2015），還被廣泛應用于畜牧養殖業，以提高動物產量和相關的經濟效益。P4會以糞便和尿液的形式進入污水處理廠，由于不能被完全去除，其在水體中的殘留往往超過正常范圍，給水生生物帶來了潛在的嚴重風險。污水處理廠廢水中的P4濃度為4.5～24.8 ng·L-1（Yarahmadiet al.，2018），豬場和奶牛場廢水中的P4濃度高達3 470～11 900 ng·L-1（Liuet al.，2012）。

環境中較低的P4殘留即可影響生物體內源激素的合成、分泌和代謝，干擾機體內環境的穩態平衡，進而影響生物體正常的生長、發育和繁殖過程。在3.5～306 ng·L-1的P4中暴露14 d，雌性斑馬魚Danio rerio的卵母細胞加速成熟且卵巢受到生理性損傷（Zucchiet al.，2013）。Wang等（2020）研究發現，在50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4處理下，雄性鯽魚Carassius auratus的精巢中出現卵原細胞，高濃度P4暴露組有更多的雌魚產生，使鯽魚性別比偏向雌性。魚類的生殖活動受下丘腦-垂體-性腺（hypothalamic-pituitary gonadal，HPG）軸的調節，Hou等（2018）發現斑馬魚在幼魚階段接觸炔諾酮可能會影響性腺分化和性別比例，并歸因于HPG軸基因表達的改變。Zhao和Fent（2016）的研究表明，晝夜節律可以調節HPG軸相關活動及各種重要的生物過程。因此，HPG軸和晝夜節律相關基因的表達改變可能干擾魚類的性腺發育，進而影響其繁殖。

魚類是低等的水生生物，其性腺發育和性別決定方式易受外界環境內分泌干擾物的影響。楊倩等（2021）研究發現，雙酚F能導致下丘腦-垂體-甲狀腺軸、HPG軸和下丘腦-垂體-腎上腺軸上一系列基因的表達水平發生改變，進而影響斑馬魚的內分泌功能。Zeilinger等（2009）發現在0.8 ng·L-1環境濃度水平的左炔諾孕酮影響下，雌魚的卵細胞結構及卵巢發育發生顯著改變。因胚胎相較于成魚和幼魚對污染物更敏感（Nagel，2002），本文以鯽魚胚胎為實驗對象，討論P4對鯽魚胚胎發育以及其對晝夜節律和HPG軸相關基因表達的影響，從而揭示P4對魚類早期胚胎的生態毒理學效應。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

孕酮標準品購自上海成捷化學有限公司，將其溶解在100%乙醇中用作儲備溶液（1 mg·mL-1），然后用脫氯自來水稀釋以獲得實驗濃度。4 ℃避光保存。

1.2 實驗動物

鯽魚購自河南師范大學水產學院水產養殖中心，置于200 L水箱中用曝氣自來水馴養1周。隨機挑選健康性成熟的親魚，用干法人工授精獲取受精卵。將正常發育的囊胚期胚胎隨機分配到直徑為180 mm的培養皿，每個培養皿中均勻分布300～500個胚胎，暴露處理144 h，至所有胚胎全部孵出。

1.3 P4毒性暴露實驗設計

一部分培養皿暴露于濃度為10 ng·L-1、100 ng·L-1、1 000 ng·L-1、10 000 ng·L-1的 P4、0.001%乙醇和曝氣自來水（空白對照組）中處理144 h，倒置顯微鏡下觀察胚胎的發育狀況，記錄死亡數、孵出數和畸形數，并選擇異常個體進行拍照；另一部分培養皿暴露于濃度為5 ng·L-1、50 ng·L-1和100 ng·L-1的P4和曝氣自來水（空白對照組）中處理144 h（乙醇溶劑終濃度低于1‰，且空白對照組和乙醇溶劑組結果不存在顯著差異，因此僅保留空白對照組），同時在暴露24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和 144 h時從每組隨機挑選20～30個胚胎，保存于液氮中。以上所有實驗均設置3個重復。每隔24 h更換暴露溶液，在整個實驗過程中，所有胚胎均維持在（26±1） ℃的溫度下，并進行光照∶黑暗（14 h∶10 h）循環。

1.4 基因轉錄水平分析

使用 Total RNA extraction reagent（TaKaRa）對鯽魚胚胎進行總RNA提取，瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測RNA的完整性和純度，使用Prime Script逆轉錄酶（TaKaRa）進行cDNA合成。利用Primer Premier 5和Oligo 7對本實驗中所要研究的基因進行特異性引物設計，在LightCycler?96實時熒光定量PCR儀中進行qRT-PCR。25 μL反應體系包括：12.5 μL 2×TransStart?Top/Tip Green qPCR SuperMix，上、下游引物（表 1）各 0.5 μL，1 μL cDNA 和10.5 μL ddH2O，反應程序為：94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s（45×）；94 ℃ 10 s，65 ℃60 s，97 ℃ 1 s；37 ℃ 30 s。選取了晝夜節律相關的6 個基因Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1，HPG軸相關基因Gnrh2、Gnrh3、Fshβ、Lhβ和類固醇生成相關基因Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β，檢測其轉錄表達水平。選40S rRNA為管家基因，實驗重復3次。使用LightCycler?96 SW1.1分析數據，所得數據采用 2-ΔΔCt計算。

1.5 數據分析

所有數據均以xˉ±SD表示，并用SPSS 16.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。統計學顯著性差異水平設置為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 P4暴露對鯽魚胚胎形態發育的影響

胚胎毒性實驗顯示，P4對鯽魚早期胚胎形態發育沒有明顯的致死、致畸效應（圖1）。在整個暴露過程中，空白對照組、0.001%乙醇對照組和4個濃度P4暴露組中的鯽魚胚胎在144 h后全部孵出，存活率分別為82.61%、78.41%、81.08%、75.63%、80.33%和82.80%，沒有顯著差異；畸形率分別為4.10%、3.70%、5.20%、3.90%、4.67%和5.07%。

圖1 P4對鯽魚早期胚胎形態發育的影響Fig. 1 Effects of P4 on morphological development in early embryos of Carassius auratus

2.2 P4對鯽魚早期胚胎發育過程中晝夜節律相關基因表達的影響

與空白對照組相比，5 ng·L-1或更高濃度的P4暴露組中，從24 h到144 h，Clock1和Arntl1基因的表達水平整體呈先升高后降低再升高的趨勢（圖2：A、B）；Cry1基因的表達水平在48 h和96 h上調（圖2：C）；Cry2和Nr1d1基因的表達水平在24 h、120 h和144 h顯著上調，而在72 h和96 h被抑制（圖2：D、E）；Per2基因的表達水平在24～96 h被抑制，但120 h后又上調（圖2：F）。

圖2 P4對鯽魚胚胎發育過程中晝夜節律相關基因表達水平的影響Fig. 2 Effects of P4 on the expression levels of circadian rhythm related genes during the embryonic development of Carassius auratus

2.3 P4對鯽魚早期胚胎發育過程中HPG軸相關基因表達的影響

與空白對照組相比，P4暴露組中Gnrh2基因的表達水平在96 h顯著降低；而5 ng·L-1P4暴露24 h、48 h和120 h， 50 ng·L-1P4暴露24 h、72 h、120 h和144 h以及100 ng·L-1P4暴露144 h后，Gnrh2基因的表達水平均顯著升高（圖3：A）。P4暴露組中，Gnrh3基因的表達水平在96 h受到了顯著誘導，而在120 h和144 h被顯著抑制（圖3：B）。P4暴露組在 72 h 以及 100 ng·L-1P4處理144 h時，Fshβ基因的表達水平顯著提高，而在其他大多數時間點被顯著抑制（圖3：C）。此外，與空白對照組相比，5 ng·L-1P4暴露處理24 h、120 h，50 ng·L-1P4暴露處理120 h以及100 ng·L-1P4暴露處理144 h后，Lhβ基因的表達水平顯著上調（圖3：D）。

圖3 P4對鯽魚胚胎發育過程中下丘腦和垂體激素相關基因表達水平的影響Fig. 3 Effects of P4 on the expression levels of hypothalamus and pituitary hormone-related genes during the embryonic development of Carassius auratus

與空白對照組相比，5 ng·L-1或更高濃度的P4處理72 h以及100 ng·L-1P4處理120 h顯著抑制Cyp11a基因的表達；而在24 h、48 h和96 h，Cyp11a基因的表達水平顯著提高（圖4：A）。在24 h和144 h，不同濃度P4暴露顯著提高Cyp19a基因的表達；而在72 h則被顯著抑制（圖4：B）。Hsd3β基因經50 ng·L-1和100 ng·L-1P4暴露處理24 h、100 ng·L-1P4暴露48 h以及5 ng·L-1P4暴露144 h，表達水平顯著提高；而在72～120 h則顯著降低（圖4：C）。不同濃度P4暴露24 h和96 h后，Hsd20β基因的表達水平顯著降低；而在72 h，Hsd20β基因的表達水平顯著提高（圖4：D）。

圖4 P4對鯽魚胚胎發育過程中與類固醇激素相關基因表達水平的影響Fig. 4 Effects of P4 on the expression levels of steroid hormone related genes during the embryonic development of Carassius auratus

3 討論

胚胎毒性實驗表明，P4濃度梯度對鯽魚早期胚胎形態發育沒有明顯的急性毒性。梁燕秋（2016）發現，暴露于10～10 000 ng·L-1P4的斑馬魚胚胎未出現死亡、畸形的情況，與本研究結果一致。胚胎是魚類發育最敏感、最脆弱、最關鍵的階段，胚胎的正常發育是魚體生長和繁殖的基本保障，因此，本文進一步研究了較低濃度P4對鯽魚胚胎的內分泌干擾效應。

晝夜節律是生物體為了適應地球自轉引起的以24 h為周期的行為、代謝、免疫等方面節律性變化，它由多個正、負調節因子組成的自我維持的反饋回路組成。Clocks、Arntls、Pers、Crys、Nr1ds構成了晝夜節律調控網絡的核心。轉錄因子Clocks和Arntls是這些反饋回路的正向組件，可以激活核心晝夜節律基因——周期（Pers）和隱花色素（Crys）的轉錄，而Per和Cry又可以與Clock/Arntl1異二聚體相互作用，抑制異二聚體的活性。此外，Clocks/Arntls異二聚體還激活核受體基因Nr1ds的轉錄（Albrecht & Eichele，2003）。Nr1d1的表達可抑制Arntl1、Pers和Crys轉錄，從而調節晝夜節律。Zhao等（2015）研究發現，孕激素能改變斑馬魚中晝夜節律及其下游信號通路的基因表達水平。Xia等（2019）發現，孕酮能影響黃河鯉Cyprinus carpiovar.幼魚中晝夜節律相關基因表達，進而導致內分泌系統的紊亂。本研究中P4暴露影響了晝夜節律信號通路相關基因（Clock1、Cry1、Cry2、Arntl1、Per2、Nr1d1）的表達，這與Zhao和Fent（2016）在斑馬魚中的研究結果類似。

晝夜節律可以驅動各種關鍵細胞和生理過程的日常振蕩，如細胞周期及其調節、激素分泌、甚至繁殖等（Bedrosianet al.，2016；Zhaoet al.，2018；Zhenget al.，2018），且Zhao和Fent（2016）研究發現晝夜節律能夠調節HPG軸的活動。HPG軸參與調節一系列生殖活動，促進和控制生殖細胞的起源、性別分化、性腺的發育和成熟。促性腺激素釋放激素（GnRH）在HPG軸中起關鍵作用。在HPG軸的cAMP級聯反應中，GnRH與垂體前葉促性腺激素細胞表面的跨膜受體結合，觸發級聯反應來調控Lhβ和Fshβ表達（Guoet al.，2003；Pawson ＆ Mcneilly，2005）。黃體生成素（LH）和卵泡生成素（FSH）控制性腺中的類固醇生成和配子發生，因此GnRH介導中樞神經系統對生殖的控制。這個過程中任何一個基因表達量的改變都可能會導致整個HPG軸的紊亂，進而影響機體的正常生長發育。本研究發現，P4處理后，Gnrh2、Gnrh3的表達水平與Fshβ、Lhβ的相一致。推測Gnrh2和Gnrh3的顯著上調可能增強了Lhβ和Fshβ的表達，從而提高FSH和LH的激素水平，并進一步調節類固醇生成基因（Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β、Hsd20β）的表達。

Cyp11a具有側鏈裂解活性，能催化膽固醇轉化為孕烯醇酮（Guoet al.，2003），在Hsd3β的催化作用下，孕烯醇酮或脫氫表雄酮能生成有活性的孕酮和雄烯二酮（Kruschet al.，1979）。Cyp19a在體內可催化雄烯二酮向雌二醇轉化，因而又稱雌激素合成酶。Walsh等（2000）研究發現LH主要通過激活Hsd20β和促進17α，20β-二羥化酮受體的轉運來促進精子和卵子的發育。本研究發現，3個不同濃度P4組處理72 h后，Fshβ的表達水平顯著上調；Cyp11a在5 ng·L-1P4處理96 h和120 h以及50 ng·L-1P4 處理 120 h 顯著上調；5 ng·L-1P4暴露144 h后，Cyp19a和Hsd3β的表達水平上調。這表明激活的FSH促進了Cyp11a、Hsd3β和Cyp19a的表達。Cyp11a、Cyp19a、Hsd3β和Hsd20β是控制類固醇生成的關鍵基因，這些基因的表達改變可降低或提高類固醇激素的合成效率。實驗室前期對暴露結束后相同P4濃度處理條件下生長至6個月的鯽魚的性別比進行了統計分析，與對照組相比，高濃度P4暴露組誘導更多雌魚產生。性腺組織學分析發現，在暴露于 50 ng·L-1和100 ng·L-1的鯽魚精巢中觀察到了卵母細胞的存在（Wanget al.，2020）。這些結果說明P4可能通過干擾類固醇合成途徑來影響鯽魚的胚胎發育，進一步影響鯽魚幼魚和成魚的性腺發育和性別比例。

4 結論

在胚胎發育階段，P4對鯽魚胚胎形態發育無急性毒性，環境相關濃度的P4可導致晝夜節律和HPG軸相關基因表達紊亂，從而導致細胞和生理代謝的紊亂，進而影響鯽魚幼魚的性腺分化和性比。本實驗闡明了孕激素物質對水生生物的生態毒理學效應以及所引起的一系列風險，為準確評估P4對水生生物的生態風險提供參考價值。