超聲波輔助解凍對南極磷蝦品質及其后續冷藏特性的影響

錢韻芳，郁佳怡，汪敏晨，張 璩，王楚妍，朱國平，施文正，楊勝平,4,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；4.農業農村部冷庫及制冷設備質量監督檢驗測試中心，上海 201306）

南極磷蝦（Euphausia superba）是當今世界資源量最大的單種生物之一，其總生物量估計達3.79億 t[1-2]，是人類開發海洋這一“藍色糧倉”優質蛋白新資源的寶庫。隨著近海漁業資源的衰退枯竭，南極磷蝦被視為一種潛力巨大的漁業資源。但南極磷蝦體內富含內源性自溶酶，死后易快速自溶[3]。隨著南極磷蝦資源開發利用的深入，冷凍南極磷蝦原料在加工前所采取的解凍方式越來越受到關注，南極磷蝦的解凍方式是影響其品質的重要因素之一。目前，有關南極磷蝦解凍研究報道主要集中在國內。例如，曹榮等[4]研究了25 ℃靜水解凍和自然空氣解凍以及4 ℃低溫空氣解凍對南極磷蝦加工品質的影響；遲海等[5]研究了15 ℃下自然解凍、靜水解凍和微波解凍以及5 ℃低溫解凍4 種不同解凍方式對南極磷蝦品質的影響，結果表明15 ℃靜水解凍更適合保證南極磷蝦品質，但解凍過程是否對南極磷蝦營養和質量造成損失等有待進一步研究，同時使用靜水解凍時需對南極磷蝦進行包裝。

近年來，超聲處理在食品中的應用也已成為研究熱點。超聲波是指頻率高于2h 104Hz的機械波，在介質中傳播時可產生熱效應、機械效應以及空化作用。超聲波在食品工業中的應用主要集中在乳化、殺菌、分離提取、霧化干燥、生物化學及促進冷凍冰晶核形成等領域[6]。有研究表明超聲波輔助解凍作為一種新型高效解凍技術，在快速、高效解凍的同時，能夠較好地保持食品品質[7]，但目前有關超聲波輔助南極磷蝦解凍的研究尚鮮見相關報道。為探究超聲波處理對南極磷蝦解凍的適用性和可行性，本實驗通過分析南極磷蝦解凍完成時及后續冷藏暫存過程中感官指標以及相關理化指標、微生物指標變化，研究超聲波輔助解凍對南極磷蝦品質的影響，以期為南極磷蝦的生產加工利用提供理論依據，也為其他冷凍水產品的解凍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦樣品于2019年2月19日在南極48.2區（南緯60°22’和西經46°41’）捕撈并冷凍運至實驗室，凍藏于－30 ℃冷凍保存箱。

鐵瓊脂培養基 青島海博生物技術有限公司；輕質氧化鎂、硼酸、鹽酸、乙醇（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力檢測試劑盒（A136-1-1）、胰蛋白酶活力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

XEBJ-1000型超聲波處理器 濟寧諧成超聲波設備有限公司；Testo875-1型紅外熱成像儀 德國Testo公司；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅儀器有限公司；VS-1300L-U型潔凈工作臺 蘇州蘇凈集團有限公司；DHP-9162型恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；iMark酶標儀 美國Bio-Rad有限公司；Kjeltec 8400型全自動凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；TA.XT.Plus型質構儀 英國SMS公司；MesoMR23-060H-I核磁共振成像分析儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

實驗時將－30 ℃凍藏南極磷蝦取出，迅速用潔凈鋼鋸分割成10 cmh 10 cmh 5 cm蝦塊，隨機分成4 組，每組隨機取3 塊樣品。分組后采用不同包裝方式和解凍條件進行解凍，A組：凍蝦塊用塑料網袋包裝，置于15 ℃水浴，靜水解凍；B組：凍蝦塊用塑料網袋包裝，置于15 ℃水浴，超聲波輔助解凍；C組：凍蝦塊用PE塑料袋包裝，置于15 ℃水浴，靜水解凍；D組：凍蝦塊用PE塑料袋包裝，置于15 ℃水浴，超聲波輔助解凍。

塑料網袋網眼孔徑為2 mmh 2 mm，采用網袋包裝與無包裝靜水解凍無明顯差異，兩種方式解凍的蝦塊均與介質水相接觸，網袋的主要作用是便于后續實驗快速收集解凍好的磷蝦樣品并濾水。超聲波處理器設置為功率600 W、頻率22 kHz。解凍完成后的南極磷蝦挑選完整個體隨機分裝，每200 g用保鮮袋分裝后立即放入4 ℃冷藏箱貯藏，冷藏過程中定期取樣進行相關品質指標檢測。

1.3.2 解凍完成時間測定

參考陳京美等[8]的方法，從凍蝦塊開始解凍計時，以蝦塊解凍至用手能輕松掰斷，且斷面處蝦體完整即認為完成解凍，記錄所用時間。

1.3.3 紅外熱成像分析

根據紅外熱成像儀說明書將紅外熱成像儀放置在解凍池中蝦塊正上方20 cm處，測量蝦塊的熱場分布并拍照。

1.3.4 感官評價

參照曹榮等[4]的方法，根據表1所示標準，由6 名經感官評價培訓的人員對解凍后的南極磷蝦進行評分，以形態、色澤、黑變程度、肌肉組織品質和氣味為評價指標，各項指標滿分均為2 分，總分10 分表示樣品品質最好。

表1 南極磷蝦感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Antarctic krill

1.3.5 微生物分析

參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》及Qian Yunfang等[9]的方法測定南極磷蝦中菌落總數和嗜冷菌數。

1.3.6 硬度測定

參照郭彤等[10]的方法測定南極磷蝦硬度。

1.3.7 總揮發性鹽基氮含量測定

參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的自動凱氏定氮儀法并略作修改測定總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量。準確稱取5.00 g南極磷蝦，用研缽研碎攪勻，用約10 mL蒸餾水沖洗進750 mL蒸餾管中，用自動凱氏定氮儀檢測TVB-N含量。

1.3.8 多酚氧化酶活力測定

取0.1 g經冰浴研缽研碎的南極磷蝦樣品，加入1 mL試劑盒中的提取液，混勻后4 ℃下8000hg離心10 min，取上清液，置于冰上待測；參照試劑盒說明書方法，取150 μL樣品于無菌EP管中，依次在EP管中加入600 μL試劑1和150 μL試劑2，于25 ℃水浴10 min后迅速放入沸水中加熱10 min，冷卻后5000hg常溫離心10 min，收集上清液，酶標儀調節波長至410 nm，用蒸餾水調零后進行檢測。按樣品鮮質量計，以每分鐘每克樣品在每毫升反應體系中使410 nm波長處吸光度變化0.01定義為一個酶活力單位。PPO活力按式（1）計算。

式中：ΔA為吸光度變化值；V反總為反應體系總體積/mL；V樣為加入反應體系中樣品體積/mL；V提為加入反應體系中提取液體積/mL；m為樣品質量/g。

1.3.9 胰蛋白酶活力檢測

參照試劑盒說明書方法，取0.2 g經冰浴磨碎的南極磷蝦樣品，加入1 mL樣品均質液，混合均勻后4 ℃下12000hg離心10 min，取上清液于冰上待用。空白管和樣品管中分別加入1.5 mL酶底物應用液，37 ℃溫育5 min，空白管中加入0.015 mL勻漿液，樣品管中加入0.015 mL待測提取液，加入樣品的同時開始計時，混勻后，倒入直徑0.5 cm的石英比色皿中，于253 nm波長處測定吸光度，記錄30 s時的吸光度A1；重新將比色皿中的反應液倒入預先編號的原試管中，放入37 ℃水浴箱中準確水浴20 min，于20.5 min時記錄吸光度A2。胰蛋白酶活力按樣品鮮質量計，根據式（2）計算。

式中：V反總為反應體系總體積/mL；V樣為取樣體積/mL；V均為均質液體積/mL；m樣為樣品質量/g。

1.3.10 低場核磁共振弛豫時間及成像分析

參考于勇等[11]的方法設置參數進行低場核磁共振弛豫時間及成像分析。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 19.0軟件通過Duncan’s法對實驗數據進行差異顯著性分析（P＜0.05），使用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦解凍紅外熱成像及解凍時間

南極磷蝦從－30 ℃冷藏箱取出迅速切割包裝后，分別進行15 ℃靜水解凍及15 ℃水浴超聲波輔助解凍，圖1為解凍30 min后各組樣品的紅外熱成像與對應實物圖。網袋包裝實物圖顏色存在差異是由于所用網袋顏色不同，其材質網孔大小等均相同。紅外熱成像圖主要用于實時監測蝦塊及水溫變化，并對水溫及時進行調控。從紅外熱成像圖中也可見蝦塊解凍過程中溫度場的分布情況，熱量從凍蝦塊表面向內部傳遞，解凍過程也是由外及里逐步進行，樣品附近水溫基本控制在15 ℃左右。

圖1 南極磷蝦解凍30 min的紅外熱成像圖和實物圖Fig.1 Infrared thermographs of Antarctic krill thawed for 30 min with different thawing treatments

如表2所示，超聲波輔助解凍的B、D組（65、75 min）南極磷蝦解凍時間明顯較靜水解凍的A、C組（105、145 min）短，且采用塑料網袋包裝的南極磷蝦比PE塑料袋包裝解凍更快。其中B組解凍耗時最短。網袋包裝使傳熱介質水能夠與凍蝦直接接觸，加快熱傳導速率，更易于解凍；且在15 ℃下水浴，超聲波輔助能夠加速南極磷蝦解凍，從而縮短解凍時間，提高南極磷蝦生產加工效率。這與超聲波加速食品解凍的空化效應、機械效應、熱效應和自由基效應等作用有關[12]。

表2 不同解凍方式解凍南極磷蝦所用時間Table 2 Thawing time of Antarctic krill with different thawing treatments

2.2 不同方式解凍對南極磷蝦感官評分的影響

解凍完成時南極磷蝦的感官評分結果如表3所示。由于解凍過程中南極磷蝦汁液滲出，塑料網袋包裝組水浴的水質渾濁，而PE塑料袋包裝組樣品雖也有渾濁液體滲出并積留在包裝袋中，但其包裝袋外的水質依然清澈。受解凍時間、南極磷蝦體內自溶酶和微生物的作用以及解凍過程滲出汁液浸泡等因素影響，C、D組蝦外觀品質較差，感官評分較低，固有氣味較強。而塑料網袋包裝南極磷蝦解凍產生的汁液大多進入浸泡水中，因此蝦個體外觀較好，尤其超聲波輔助解凍的B組感官得分較高，可見超聲波輔助不僅可以加速南極磷蝦解凍，還具一定的清洗作用，可以去除解凍后產生的乳白色組織液，同時還可能起到去除內源酶的作用，延緩黑變和抑制蛋白質降解等反應。

表3 不同方式解凍完成時南極磷蝦的感官評分Table 3 Sensory evaluation of Antarctic krill after different thawing treatments

如圖2所示，在后續冷藏過程中各組樣品的感官評分均逐漸下降。塑料袋包裝靜水解凍的C組磷蝦樣品在冷藏第28小時蝦身變柔軟，大部分呈溶解狀，保鮮袋內積累了乳白色蝦汁液，其整體感官品質明顯差于網袋包裝的磷蝦樣品，而對比相同包裝方式，超聲波輔助解凍的D組磷蝦樣品蝦體較為飽滿，感官品質略好。塑料網袋包裝組磷蝦樣品在冷藏第28小時的感官評分明顯高于塑料袋包裝組，這是由于采用塑料網袋包裝的南極磷蝦凍塊在解凍過程中含有自溶酶的解凍汁液溶于水中，網袋中磷蝦樣品自溶酶含量較少，從而使冷藏期間磷蝦蛋白降解相對緩慢[13]。

圖2 經不同方式解凍后南極磷蝦冷藏過程中的感官評分Fig.2 Sensory evaluation of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.3 不同方式解凍對南極磷蝦冷藏期間微生物數量的影響

如圖3所示，解凍前南極磷蝦的初始菌落總數為1.94（lg（CFU/g）），遠低于目前全球產量第一的凡納濱對蝦新鮮樣品[14]，說明南極磷蝦生長的低溫環境使其攜帶的微生物數量較少，且捕撈后直接船上凍結并于低溫下凍藏保存能夠較好地抑制微生物的生長繁殖。解凍后0 h，A、B組菌落總數有所升高，而C、D組沒有明顯變化，這可能是由于網袋包裝的磷蝦在解凍時接觸到水中存在的微生物，而PE塑料袋隔水解凍能夠較好地阻隔磷蝦與水，從而避免了水體中微生物的污染。但在冷藏28 h期間，所有樣品的菌落總數始終變化不大，且均處在較低水平（低于2.5（lg（CFU/g））），這可能是由于南極磷蝦自身所攜帶的大多為嗜冷微生物，這些微生物在4 ℃低溫環境下較短時間內不能快速復蘇并增殖。一般認為，菌落總數超過106CFU/g表明水產品發生腐敗[15]，而本研究中微生物數量始終較低，說明微生物腐敗不是解凍磷蝦在冷藏過程中品質劣變的主要原因。

圖3 不同方式解凍南極磷蝦冷藏過程中菌落總數的變化Fig.3 Changes in total viable count of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

如圖4所示，解凍后南極磷蝦中嗜冷菌數從解凍前的1.16（lg（CFU/g））快速增長至1.67～1.78（lg（CFU/g）），而在冷藏期間嗜冷菌數增長緩慢。南極磷蝦中的嗜冷菌主要來源于捕獲前其所生活的自然水體[16]，這類微生物能夠適應低溫[17]，并且在解凍處理后能一定程度恢復生長活性[18]。冷藏28 h期間，各組嗜冷菌數均呈緩慢上升趨勢，但與菌落總數一樣始終維持在較低水平，其中超聲輔助解凍B、D組嗜冷菌數分別略高于相同包裝靜水解凍A、C組，說明超聲輔助解凍處理可能由于機械振動和空化效應[12]促進微生物在蝦肉組織中的擴散，一定程度上為微生物的生長繁殖拓展了空間，更有利于微生物對營養物質的攝取。

圖4 不同方式解凍南極磷蝦冷藏過程中嗜冷菌數的變化Fig.4 Changes in total psychrophilic bacterial count of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.4 不同方式解凍對南極磷蝦冷藏期間硬度的影響

由于磷蝦個體小，去殼容易造成肌肉損傷，因此實驗中選擇大小一致的整蝦進行測定。如圖5所示，解凍后冷藏第0小時網袋包裝超聲波解凍組南極磷蝦的硬度高于靜水解凍組，這可能是超聲解凍能較好地維持南極磷蝦硬度，也有可能是因為靜水解凍處理組在水中浸泡時間更長所致；而此時塑料袋包裝的超聲波解凍組與靜水解凍組硬度差別不大，有可能是因為塑料袋包裝對于超聲波具有一定的阻擋作用，同時塑料袋對水具有阻隔作用，從而避免了水的浸泡。超聲波對肌肉組織破壞與否與超聲波功率有一定關系，超聲波功率過大也會導致肌肉組織破碎，因此選擇合適的超聲功率十分重要[19]。冷藏中后期12～28 h，網袋包裝或塑料袋包裝的靜水解凍組樣品硬度普遍高于其對應的超聲波解凍組，說明靜水解凍磷蝦樣品的質構特性在冷藏過程中較超聲波解凍磷蝦樣品保持效果好，有可能是因為超聲波作用導致肌肉組織結構遭到破壞，使南極磷蝦硬度下降。但南極磷蝦解凍后整個冷藏期間各處理組間硬度差異并不明顯，由此可見，硬度并不是評判南極磷蝦解凍冷藏品質的適宜指標。

圖5 不同方式解凍南極磷蝦冷藏過程中硬度的變化Fig.5 Changes in hardness of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.5 不同方式解凍對南極磷蝦冷藏期間TVB-N含量的影響

水產品在內源酶和微生物的作用下會產生小分子堿性氨氮類化合物，即TVB-N，其含量可作為水產品腐敗的評價指標[20]。如圖6所示，解凍前南極磷蝦中TVB-N含量僅為10.70 mg/100 g，與解凍前相比，解凍完成后即第0小時A組的TVB-N含量與解凍前相比變化不大，但B、C、D組分別達到16.29、19.01 mg/100 g和18.93 mg/100 g。冷藏期間各組TVB-N含量均呈上升趨勢，塑料袋包裝組整體略高于塑料網袋包裝組，其中D組樣品在貯藏末期TVB-N含量較高，說明超聲輔助解凍結合塑料袋包裝的磷蝦更容易分解形成小分子氨氮類化合物，這可能是由于D組南極磷蝦采用具有阻隔性的PE塑料袋包裝，解凍產生含有蛋白溶解酶的汁液積存在袋內造成蛋白質的分解，而微生物對分解后的蛋白質也能更好地進行利用。因此，內源酶和微生物共同作用導致了南極磷蝦TVB-N含量升高。

圖6 不同方式解凍南極磷蝦冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig.6 Changes in TVB-N value of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.6 不同方式解凍對南極磷蝦冷藏期間PPO活力的影響

如圖7所示，解凍前后南極磷蝦中PPO活力無明顯變化，但在冷藏過程中各組PPO活力均呈先上升后下降趨勢，這與凡納濱對蝦在冷藏過程中PPO活力的變化規律[21]相似。尤其在冷藏后期，C組PPO活力明顯高于其他3 組，且在冷藏24 h達到最大值，而A、B組PPO活力始終維持在較低水平。這可能是因為A、B組磷蝦用網袋包裝浸泡在水中解凍時，PPO酶原隨解凍汁液流失到水中，一定程度上使可被激活的PPO酶原含量減少，而C組與D組采用具有一定阻隔性的PE塑料袋包裝，PPO或酶原積留在袋內的解凍汁液中。但D組南極磷蝦PPO活力卻低于C組，這可能與超聲波處理破壞了酶活性中心結構有關[22]，其具體原因有待進一步研究。

圖7 不同方式解凍南極磷蝦冷藏過程中PPO活力的變化Fig.7 Changes in PPO activity of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.7 不同方式解凍對南極磷蝦冷藏期間胰蛋白酶活力的影響

南極磷蝦具有較強的自溶特性和低溫活性，其中胰蛋白酶是其主要的自溶酶之一[23-24]。如圖8所示，解凍前南極磷蝦胰蛋白酶活力較低，說明凍藏能夠抑制胰蛋白酶活力，但不能使其完全滅活。解凍后冷藏期間磷蝦中的胰蛋白酶活力呈先快速上升后下降的趨勢，說明解凍后磷蝦胰蛋白酶活力被迅速激發。其中A組胰蛋白酶活力在冷藏第6、12小時達到峰值，B組胰蛋白酶活力在解凍后快速上升，其后18 h內基本維持穩定，C組解凍后胰蛋白酶活力上升不明顯，但在冷藏6～18 h內一直維持在較高水平，而D組在解凍后胰蛋白酶活力快速上升，并且在其后18 h內一直維持在20h 102U/g以上。結果表明，PE塑料袋包裝隔水解凍磷蝦樣品的胰蛋白酶活力整體較高，而網袋包裝樣品在超聲清洗作用下流失部分組織酶液，使酶活力有一定下降。在南極磷蝦冷藏后期，胰蛋白酶活力迅速下降，這可能是因為在冷藏末期南極磷蝦自溶接近完全，胰蛋白酶激活了胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原、彈性蛋白酶原等蛋白酶原[25]，這些蛋白酶進而分解胰蛋白酶，使胰蛋白酶活力快速下降。

圖8 不同方式解凍南極磷蝦冷藏過程中胰蛋白酶活力的變化Fig.8 Changes in trypsin activity of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

2.8 不同方式解凍對南極磷蝦冷藏期間水分分布的影響

圖9為不同解凍方式處理的磷蝦冷藏前后低場核磁共振成像偽彩圖，其中不同顏色表示樣品中水分信號的強弱，顏色越紅表示信號越強、水分含量越高，顏色越藍則水分含量越低[26]。各組樣品蝦頭處顏色相對偏紅，說明水分含量較高，而蝦尾處顏色偏藍，水分含量較低。冷藏28 h后各組樣品磷蝦整體呈紅黃色，其中A組蝦頭部紅色區域較小，整體偏黃藍色，B、D組樣品紅色區域比例相對較大，說明超聲輔助解凍的樣品在冷藏后水分流失較靜水解凍少。

圖9 不同方式解凍南極磷蝦冷藏前后的低場核磁共振成像偽彩圖Fig.9 Low field nuclear magnetic resonance pseudocolor images of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

采用低場核磁共振技術分析得到經不同方式解凍后南極磷蝦在不同冷藏階段的水分信號峰面積。如圖10所示，磷蝦樣品中不易流動水占比最大，結合水和自由水相對占比較小。解凍后冷藏期間4 組樣品的總水分信號峰面積逐漸降低，而自由水峰面積略有增加，其中A、C組變化程度略小于B、D組，這可能是超聲波的空化效應導致不易流動水更容易向自由水轉變。但與雞肉相比[27]，超聲處理對南極磷蝦水分組成的影響并不明顯。

圖10 不同方式解凍南極磷蝦冷藏期間水分信號峰面積的變化Fig.10 Changes in water content of Antarctic krill with different thawing treatments during cold storage

3 結論

本研究發現不同解凍方式能夠對南極磷蝦貯藏品質穩定性產生影響，且解凍后冷藏南極磷蝦的品質劣變主要與內源酶有關，而微生物作用相對較弱。從解凍速率方面看，超聲波輔助解凍能夠縮短解凍時間，提高生產效率。超聲波輔助解凍還具有一定的清洗作用，通過降低網袋包裝南極磷蝦中PPO和胰蛋白酶活力，從而延緩磷蝦黑變和蛋白質水解，使解凍后的南極磷蝦冷藏時間延長，更有利于磷蝦后續的生產加工。