膳食纖維對大鼠鈣平衡及骨生物力學性能的影響

覃香香，周玉恒，陳海珊，蔡愛華，劉金磊

（廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西植物功能物質與資源持續利用重點實驗室，廣西木質纖維素生物煉制工程技術研究中心，廣西 桂林 541006）

鈣不僅是構成骨骼最主要的無機元素，同時廣泛參與機體各項生理活動的調節，如凝血、神經元傳遞、肌肉收縮、細胞內信號傳導、激素分泌、調節心律和血壓等[1-2]。整個生命周期中充足的鈣攝入對于骨骼健康和正常生理代謝十分必要[3-6]。鈣攝入不足可增加人體罹患骨質疏松以及各種慢性代謝性疾病的風險，兒童缺鈣還會引起骨骼發育不良[7]。據統計，目前中國人均每日鈣攝入量僅為345.03 mg，遠低于800 mg的每日需要量，鈣攝入不足人口比例超過95%，在中國居民缺乏的營養素中排名第一[8]。

除了需要攝入足夠的鈣，鈣的吸收和利用是衡量補鈣效果的重要參數。有研究表明單純地攝入鈣和VD無法降低老年人骨折發生的比例[9-10]。影響鈣吸收和利用的因素包括性別、年齡、藥物、疾病、食物等。其中，食物的各種營養成分是影響鈣腸道吸收和體內生物利用度的重要因子[11]。尤其是被譽為人體第七營養素的膳食纖維，不僅影響鈣的吸收和利用，也影響體內骨轉換、骨密度，是骨代謝中一個重要的調節因子[12-14]。

膳食纖維是指不能被人體消化液所消化，但是卻能夠被共生在腸道（主要是結腸）的微生物所發酵，并對機體代謝產生調節作用的植物成分（通常是多糖）。世界各國的衛生組織都對國民的膳食纖維攝入量給出指導（推薦每日攝入25～40 g膳食纖維），但在膳食纖維種類選擇上沒有進一步的建議。膳食纖維是一大類在結構單元、聚合度、化學鍵種類、分支程度和支鏈基團等結構上有很大差異的化學物質，它們在分子質量、溶解程度、黏稠度、生物可降解性等理化性質上都表現出顯著不同[15]。一些研究發現不同結構的膳食纖維對脂代謝、糖代謝產生不同的影響[16-18]。但目前針對谷類、水果類、根莖類等食品中出現頻率最高的一些大分子膳食纖維的比較研究仍然缺乏。

本實驗通過7 種不同的純化膳食纖維或膳食纖維混合物，以小麥麩皮作為參照，研究它們在鈣的腸道吸收、血清鈣水平、尿鈣排泄、骨鈣含量、骨最大載荷等方面的差異，分析其差異規律和可能原因，為進一步研究缺鈣和骨質疏松的膳食預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

70 只SPF級雄性SD大鼠（Rattus norregicus）購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004；使用許可證號：SYXK（桂）2020-0002），鼠齡2 個月，體質量約（200±20）g，適應性飼養2 周。飼養條件：溫度25 ℃、相對濕度40%～60%，自由攝食、飲水，光照/黑暗周期為12 h/12 h。

蔗渣木聚糖和蔗渣纖維素為自制，制備方法參考文獻[19-20]；麥麩為普通市售；菊粉 青海威德特種糖業有限公司；魔芋膠 河南正興食品添加劑有限公司；果膠煙臺安德利果膠股份公司；氯化鑭 天津市精細化工研究所；Ca、Mg（質量濃度1000 μg/mL）單元素標準溶液 國家標準物質研究中心；HNO3（優級純）廣州化學試劑有限公司；HClO4（優級純） 天津政成化學制品有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AG-201型電子式萬能試驗機 日本島津公司；NOVAA400P原子吸收分光光譜儀 德國耶拿分析儀器股份有限公司；DK-98-11實驗電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；SX2-2.5-10A箱式電阻爐 上海索域試驗設備有限公司；DB-1AB電熱板 邦西儀器科技（上海）有限公司；AC9000全自動電解質分析儀 江蘇奧迪康醫學科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養

將SPF級雄性SD大鼠隨機分成7 組，每組10 只，每組大鼠在基礎飼料中分別加入50 g/kg的纖維素、木聚糖、果膠、菊粉（果聚糖）、魔芋（葡甘露聚糖）、麥麩（對照組）、混合飼料（m（木聚糖）∶m（纖維素）∶m（果膠）∶m（菊粉）∶m（魔芋）＝6∶0.5∶1∶2∶0.5）。基礎飼料為美國營養學會（American Institute of Nutrition，AIN）所推出適用于成年期嚙齒動物的純成分飼料改良配方AIN-93M，每千克干飼料含鈣5 g。

1.3.2 樣品采集

大鼠飼養8 個月后進行尾部采血，尿液和糞便用代謝籠收集，收集前先將大鼠在代謝籠適應性飼養24 h，之后收集48 h糞便、尿液，并記錄飼料48 h攝入量。大鼠飼養9 個月后進行宰殺，剝離后肢左右股骨。

1.3.3 鈣吸收率測定

天然的吸附材料來源廣泛，但會有吸附率低、吸附中藥材里有效成分的缺點，可以針對這兩點為參照對材料進行結構修飾后，增大其吸附量。使其不僅能應用于水體中重金屬的脫除，還能對中藥水提液的重金屬離子達到理想的吸附效果。

收集48 h的糞便，70 ℃烘干48 h，然后研缽研碎成粉，稱取1 g糞便干粉樣品，放入瓷坩堝（40 mL），置于電爐上加熱碳化至無煙，放入箱式電阻爐進行灰化。灰化條件為600 ℃持續8 h。待電阻爐冷卻取出瓷坩堝，向瓷坩堝加入1 mL質量濃度100 g/L的HNO3溶液溶解，并用超純水定容至100 mL，測定前用質量濃度10 g/L HNO3適當稀釋，用原子吸收光譜儀測定422.8 nm波長處吸光度，以鈣質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y＝18.074x＋0.2853（R2＝0.9981）。飼料的處理方法和鈣含量檢測方法同糞便，計算48 h飼料攝入總量所含的鈣總量，并換算鈣日平均攝入量。鈣吸收率計算如公式（1）～（3）所示。

式中：m1為鈣日平均攝入量/mg；m2為糞鈣日平均排出量/mg；n為檢測時樣品稀釋倍數；V為樣品總體積/mL；m3為48 h內攝入的飼料總量/g；m4為預處理過程取樣量/g；m5為48 h內糞便總量/g。

1.3.4 血鈣濃度測定

剪尾采血1.0 mL，靜置30 min，3000 r/min離心10 min，取上清液，采用電解質分析儀測定血清中的總鈣、游離鈣、結合鈣濃度。

1.3.5 鈣保留率測定

將48 h內收集的所有尿樣混合均勻，10000 r/min離心10 min，量取尿液總體積，取1 mL澄清尿液，用質量濃度10 g/L HNO3稀釋，并用原子吸收光譜測定其中的鈣含量，計算每日尿鈣日排出量。鈣保留率計算如公式（4）所示。

式中：m1為鈣日平均攝入量/mg；m2為糞鈣日平均排出量/mg；m3為尿鈣日平均排出量/mg。

剝離的左股骨用超純水洗凈表面，放置烘箱烘至恒質量，然后放入坩堝內，置于箱式電阻爐中進行灰化，灰化溫度為600 ℃，灰化時間為6 h，灰化結束后取出，在坩堝中加入5 mL質量濃度100 g/L的HNO3溶液溶解，再用超純水定容至100 mL，適當稀釋至檢測值在標準曲線范圍內，用原子吸收光譜儀測定骨鈣含量。

1.3.7 右股骨三點彎曲實驗

大鼠飼養9 個月后，處死后剝離后肢左、右股骨，右股骨用浸有生理鹽水的紗布裹住，置于－20 ℃下保存。實驗前取出冰凍的右股骨，解凍至室溫25 ℃，在電子式萬能試驗機上進行生物力學性能測試。測試條件：跨距為20 mm、加載速率為5 mm/min，記錄載荷變形曲線，在曲線上讀出骨最大載荷參數。

1.3.8 原子吸收光譜法檢測

取0.1 mL待測溶液，加入2 mL氯化鑭溶液和7.9 mL超純水，搖勻，原子吸收光譜儀進樣檢測，儀器工作條件見表1。

表1 原子吸收光譜儀工作條件Table 1 Working conditions of atomic absorption spectrometer

1.4 數據統計與分析

實驗數據以平均值±標準差表示，利用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同膳食纖維對腸道鈣吸收的影響

膳食鈣是機體鈣的唯一來源，鈣的腸道吸收對機體鈣平衡的維持至關重要[21]。與鈣的腸道吸收有關的參數主要包括鈣攝入量、糞鈣排出量、鈣吸收量、鈣吸收率。從表2可以看出，木聚糖組鈣日平均攝入量顯著高于麥麩組（P＜0.05），并高于其他各組，但由于木聚糖有促排便作用（數據未顯示），導致木聚糖組糞鈣日平均排出量大于其他組，且鈣吸收量（P＜0.05）和鈣吸收率都顯著或極顯著低于麥麩組（P＜0.01）；在本課題組之前研究中發現魔芋組單位質量的糞便中鈣含量偏高[20]，本實驗中雖然魔芋組排便量不大，但是糞鈣日平均排出量也偏高，且鈣吸收量和鈣吸收率極顯著低于麥麩組（P＜0.01）和其他實驗組。總地來說，麥麩組、纖維素組的鈣吸收量、鈣吸收率高于混合組、木聚糖、果膠、菊粉、魔芋組，其中麥麩組鈣吸收量和木聚糖、果膠、魔芋組之間具有顯著性差異（P＜0.05、P＜0.01），鈣吸收率與木聚糖組和魔芋組具有極顯著性差異（P＜0.01）。

表2 不同膳食纖維對鈣腸道吸收的影響Table 2 Effects of different dietary fibers on intestinal absorption of calcium

2.2 不同膳食纖維對血清鈣水平的影響

從表3可以看出，血清游離鈣濃度在不同膳食纖維組間無顯著性差異（P＞0.05），但是纖維素、木聚糖、果膠、菊粉組血清結合鈣濃度和總鈣濃度均顯著小于麥麩組（P＜0.05、P＜0.01）。血清鈣（主要是游離鈣）的穩定對于維持細胞正常的生理功能至關重要，正常情況下，機體血鈣水平受到甲狀旁腺激素、降鈣素和1,25-(OH)2D3的精確調節，通過骨骼、腎臟、小腸來共同維持血鈣的動態平衡，保證機體正常生理功能的進行[21]。由表3可知，麥麩組在結合鈣（游離鈣的臨時儲庫）濃度和總鈣濃度上高于其他純化的膳食纖維組，因此，麥麩更有利于穩定血鈣。

表3 不同膳食纖維對血清鈣水平的影響Table 3 Effects of different dietary fibers on serum calcium levels

2.3 膳食纖維對尿鈣流失和鈣保留率的影響

腎臟是調節鈣平衡的一個重要的器官，其能夠通過重吸收來減少鈣的尿排泄。圖1表明，相對麥麩組，纖維素組和木聚糖組可以顯著或極顯著減少尿鈣流失（P＜0.05、P＜0.01）；而果膠組尿鈣日排出量極顯著高于麥麩組（P＜0.01），且明顯高于其他各組。

圖1 不同膳食纖維對尿鈣的影響Fig.1 Effects of different dietary fibers on urinary calcium levels

鈣保留是鈣攝入、鈣的腸道吸收、尿鈣排泄共同作用的結果。從圖2可以看出，果膠組和魔芋組鈣保留率極顯著低于麥麩組（P＜0.01），尤其是果膠組由于尿鈣流失過多，出現了負鈣平衡。總地來說，麥麩、混合物、纖維素組鈣保留率高于木聚糖、果膠、菊粉、魔芋組。

圖2 不同膳食纖維對鈣保留率的影響Fig.2 Effects of different dietary fibers on calcium retention

2.4 膳食纖維對骨鈣含量和骨生物力學性能的影響

骨鈣含量是鈣平衡的結果，由表4可知，鈣保留率比較高的麥麩組、混合組、纖維素、木聚糖組、菊粉組骨鈣含量也比較高，除了果膠組骨鈣含量顯著低于麥麩組以外（P＜0.05），其余各組與麥麩組并沒有顯著性差異（P＞0.05）。

骨生物力學性能是骨強度的最直觀體現，而骨最大載荷是骨生物力學性能的最主要評價指標，從表4可以看出，骨鈣含量與麥麩組沒有顯著差異的木聚糖組（P＞0.05），其骨最大載荷顯著高于麥麩組（P＜0.05），由此可見，骨強度不僅與骨鈣含量有關，還與骨微結構、骨轉化率、礦化程度、微損傷累積及修復、膠原礦物基等其余骨質量因素有關[22]。本實驗結果同時表明，果膠組尿鈣的過度流失會引起負鈣平衡，使得骨鈣含量大幅度降低，最終導致骨生物力學性能下降（圖2、表4）。

表4 不同膳食纖維對骨鈣含量和骨最大載荷的影響Table 4 Effects of different dietary fibers on bone calcium content and maximum load

3 討論

3.1 膳食纖維結構對鈣吸收的影響

食物中的鈣鹽以游離鈣的形式從消化道進入人體體液循環的過程稱為鈣吸收。90%的鈣吸收發生在小腸，其次是結腸。膳食纖維由于非消化的特性，可以完整地穿過小腸，到達結腸后被共生在腸道的菌群分解并代謝產生各種短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），降低了腸道環境的pH值。因此，有研究將一些膳食纖維促進鈣吸收的作用歸因于酸化腸道、SCFAs促進腸道上皮生長從而增加吸收面積等因素[23-24]。以此類推，鈣吸收率應該和SCFAs的產量成正比。然而，本研究出現與上述理論不一致的結果，以纖維素和木聚糖為例，纖維素是β-葡聚糖的高度結晶體，具有最少的降解率和SCFAs產量；而木聚糖是多種單糖的不定型聚合物，雖然不溶于水，卻具有很高的親水性，在水中通常是呈現均勻的乳濁液狀態，這種物理特性使得木聚糖具有極高的酶解可及性，很容易被腸道微生物利用，在大鼠的腸道末端的消化率可達到85%[25]，因而具有遠高于纖維素的SCFAs產量[26]，但它們在鈣吸收量和鈣吸收率上卻呈現出和SCFAs產量相反的結果。其他組別也出現類似的趨勢，即低發酵型膳食纖維如麥麩、纖維素的腸道鈣吸收量和鈣吸收率高于高發酵型膳食纖維如木聚糖、果膠、菊粉、魔芋、混合組（表2）。Mneo等[27]利用Ussing chamber技術進行研究發現，在腸道中單純降低pH值不會影響到鈣吸收，因此，降低腸道pH值似乎不是膳食纖維促鈣吸收的主要機制，單純從結腸的發酵和SCFAs產量方面并不能完全解釋膳食纖維對鈣吸收的差異。

可溶性或分散性良好的膳食纖維如木聚糖、果膠、魔芋、菊粉、混合組比難溶的纖維素、麥麩在腸道中更容易與腸道內容物充分接觸，它們本身的結構特點及理化性質增加了與礦質離子相互作用的可能性。例如，木聚糖的結構中除了木糖、阿拉伯糖、半乳糖等中性糖以外還含有葡萄糖醛酸基、乙酰基、未脫除干凈的木質素酚基基團，果膠是半乳糖醛酸聚合物，本身帶有陰離子基團且易溶于水，它們對礦質元素都具有吸附螯合和包裹的雙重作用；魔芋是葡萄糖和甘露糖的聚合物，菊粉是果糖的聚合物，二者雖然不帶電荷，但其大分子可溶物呈現的凝膠性能對腸道營養物質具有隔離、包裹作用。這種理化特性能夠減少例如淀粉、脂肪等營養物與消化酶的接觸，從而降低營養物質的吸收[28]，這也是膳食纖維抗糖抗脂的機制之一，對于礦質元素也可能起著同樣的作用。

麥麩和纖維素具有相似的鈣吸收量和鈣吸收率，它們都是難溶性膳食纖維。有研究報道了麥麩所含的植酸具有抗營養作用，是引起鈣吸收減少的原因之一[29]，但本研究結果中，麥麩組鈣吸收率并不比那些不含植酸的純化膳食纖維低。植酸一般存在于小麥堅硬的糊粉層細胞胞漿中[30-31]，與堅固光滑的小麥皮層黏在一起，即使經過腸道消化過程可能也很難被釋放出來，工業上提取也要經過比較劇烈的條件才能將植酸脫離附著物[32]，這可能是麥麩組沒有受到植酸干擾的原因。也有學者認為麥麩減少鈣吸收的研究通常是短期的結果，從長期的適應性上看并沒有對鈣吸收產生負面影響。總體而言，鈣吸收受到影響的因素很復雜，膳食纖維由于種類眾多，理化性質表現出很大的差異，不同的膳食纖維對鈣吸收的影響可能存在不同的機制。但作為吸收鈣的主要部位，在小腸腸道內理化性質的不同所導致的鈣吸收差異可能是比結腸發酵產酸更重要的一個機制。

3.2 不同膳食纖維對鈣的體內利用的影響

在鈣的體內利用階段，膳食纖維的作用更多的是通過代謝產物進行間接的調節，只有代謝產物才能穿過腸道細胞屏障進入血液中，影響更遠端的器官。目前已知的主要代謝產物是各種SCFAs[23]，尤其是丁酸被認為具有可以抑制骨吸收、降低骨的溶解流失的作用[33]。有研究表明，糞便中總SCFAs濃度從大到小依次是混合組＞木聚糖＞魔芋＞麥麩＞菊粉＞果膠＞纖維素，丁酸濃度從大到小依次是木聚糖＞菊粉＞果膠＞混合組＞魔芋≈麥麩＞纖維素[26]，而本研究中骨鈣含量從大到小依次是混合組≈纖維素≈菊粉≈麥麩≈木聚糖≈麥麩＞魔芋＞果膠，骨最大載荷從大到小依次是木聚糖＞纖維素≈麥麩≈混合組≈菊粉≈魔芋膠＞果膠。顯然，不能完全以SCFAs或丁酸濃度來解釋膳食纖維之間在骨鈣含量和骨生物力學性能上的差異。Weaver等[34]的研究也證明骨的性能與SCFAs產量關系并不密切，與本研究結果一致。除了代謝產物，腸道微生物也是膳食纖維發揮作用的重要機制和當今研究的熱點之一[35-37]。然而，無論是腸道微生物還是腸道代謝產物，膳食纖維如何影響腸道微生態，腸道微生態的改變又是如何精確聯系到遠端器官功能改變，它們聯系的分子機制是什么，仍有待進一步的研究。

3.3 純化膳食纖維能否作為麥麩的替代品

禾本科谷物是人類的主食之一，禾本科谷物膳食纖維是人們所需膳食纖維的最主要來源，糧食的精加工使得谷物膳食纖維成為現代飲食最缺乏的膳食纖維。與此同時，眾多純化的膳食纖維補充劑作為商品進入市場。以人們自然飲食中最典型的麥麩作為膳食纖維參照，比較幾種不同結構的純化膳食纖維對鈣平衡及其影響，結果顯示麥麩組在鈣吸收率和鈣保留率上均高于除纖維素以外的單一純化膳食纖維，混合組比單一純化膳食纖維更接近麥麩組。關于膳食纖維的補充原則，張厚德等[38]詳細地論述了平衡膳食纖維對健康的重要性，本實驗結果也進一步證明，單一純化膳食纖維在維持鈣平衡上仍然存在一定的缺陷，復合型膳食纖維更合理。

4 結論

不同結構的膳食纖維對鈣的腸道吸收、鈣在機體內的利用、鈣在骨骼中的沉積、尿鈣排泄量、鈣保留和骨的生物力學性能等的影響存在差異，低發酵性膳食纖維有利于鈣的吸收和更高的鈣保留率。在純化的膳食纖維中，木聚糖比麥麩更能顯著提高骨的生物力學性能，而果膠的作用相反。