鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠泌乳功能的促進作用

蔣 博，汪金林，王海燕，高瑞昌，徐新星，白 帆，趙元暉,*，劉 康,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.衢州鱘龍水產食品科技開發有限公司，浙江 衢州 324002；3.海信家電集團股份有限公司，山東 青島 266071；4.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

母乳喂養被認為是世界上最好的哺乳方式。母乳具有營養全面的優勢，在促進嬰兒免疫系統發育方面發揮重要作用，能充分滿足嬰兒的生長發育需求。近年來，母乳喂養得到越來越多家庭的重視，但隨著社會壓力、工作節奏、生活習俗、飲食結構變化以及高齡產婦數量增加等多種因素影響，產后缺乳的癥狀呈逐年增高的趨勢[1]。據中國發展基金會2019年的報告顯示，約有40%以上的產婦存在缺乳、少乳和稀乳的癥狀，目前我國嬰兒6 個月內純母乳喂養率僅為29.2%[2]。

目前多數關于缺乳的治療研究是基于中藥及其相關提取物的開發和應用。Lin Man等[3]探究了槲皮素對產后缺乳模型小鼠的治療效果及其作用機制，結果發現槲皮素可通過刺激垂體分泌催乳素（prolactin，PRL）以及乳腺中催乳素受體（prolactin receptor，PRLR）等物質，明顯改善缺乳小鼠的泌乳量并提高乳汁質量；董世起[4]研究中藥催乳湯對溴隱亭致大鼠產后缺乳的保護作用，驗證了催乳湯可以顯著提高大鼠血清催乳素濃度。盡管中藥對產后缺乳具有促進作用，但是傳統中藥湯劑熬制過程繁瑣、加工時間長以及中藥味苦等使得中藥的缺乳治療存在一定限制[5]。

PRL是由動物腦垂體合成與分泌的一種單鏈多肽類激素，具有促進機體生長、乳腺發育，啟動和維持泌乳等多種作用[6-7]。已有文獻報道魚類腦垂體和多個滲透調節器官含有催乳素[8]，一些學者也已對羅非魚、鯉魚、肺魚、鱘魚等多種魚類的PRL進行分離、鑒定和抗體制備等研究[9-12]。已有文獻報道鱘魚等一些軟骨魚類PRL的一級結構與哺乳動物類似，都同樣含有3 個二硫鍵[13-14]，但目前鮮有研究探究其是否具有促進泌乳的功能。我國傳統的豬蹄湯、魚湯等為目前缺乳產婦普遍采用的催乳食療方法。但因其成分復雜、加工方式不一，尚缺乏理論研究基礎，無可靠數據支撐。

本實驗精煉完善鱘魚頭湯的制作工藝，使其易于加工且產物不含藥物成分，對產婦和嬰兒具有一定的安全性，同時減少傳統中藥湯劑等繁瑣的加工工序以及味苦的缺陷；此外，利用甲磺酸溴隱亭構建產后缺乳大鼠模型[15]，以乳清蛋白鱸魚粉灌胃母鼠為陽性對照，考察鱘魚頭湯促泌乳的功效；進一步通過生理生化實驗探討可能的催乳機理，以期為鱘魚頭湯有效改善產后缺乳癥狀提供一定理論參考，并為食品催乳應用研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8 周齡哺乳期雌性Wistar大鼠24 只，分娩時間相差不超過24 h，體質量（300±20）g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產許可證號：SCXK（魯）2019-0003。

鱘魚魚頭 杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司。

乳清蛋白鱸魚粉 益倍健康科技（武漢）有限公司；一抗（PRL兔單克隆抗體、β-酪蛋白（β-casein，β-CN）兔單克隆抗體） 美國Abcam公司；二抗（辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔單克隆抗體）、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液、蘇木素染液 武漢賽維爾生物科技有限公司；PRL、PRLR、β-CN、α-乳清蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、乳糖合成酶（lactose synthase，LS）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海臻科生物科技有限公司；RNA提取試劑、逆轉錄試劑、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

倒置顯微鏡 日本Olympus公司；全自動酶標儀、低溫高速離心機 美國賽默飛世爾科技公司；基因擴增儀杭州朗基科學儀器有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；LE2002E電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；LGJ-10C真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；F-50微型反壓滅菌釜 山東創美機械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚頭湯的制備

工藝流程：養殖→宰殺→取鱘魚頭→切割預處理→清洗蒸煮→分離漂洗→初次熬制→高壓液化魚頭軟骨→篩網過濾→二次熬制及調味→稱量及罐裝→滅菌

主要操作步驟：1）原料預處理：先將漂洗后的魚頭放入蒸箱中蒸煮，然后分離魚頭肉、脂肪和軟骨，分別漂洗5 min。2）一次熬制與高壓液化：將（魚頭肉＋脂肪）與水按質量比1∶1.5熬制成肉糜狀態，過200 目篩網；將魚頭軟骨與水按質量比1∶1.5加入微型反壓滅菌釜，并按照滅菌釜的通用參數設置，通過熱處理使原料充分壓化至液態，過200 目篩網。3）產品的二次熬制：將過濾好的魚頭肉和脂肪等的湯汁與過濾好的魚頭軟骨汁液充分混勻后進行二次熬制，同時按照調味配方進行調味，熬制、熱罐裝并殺菌。

1.3.2 實驗動物分組及造模

8 周齡哺乳期雌性Wistar大鼠24 只，Wistar大鼠分娩當日記為第0天，適應性喂養3 d后，每窩帶有的仔鼠數量均為10 只，使用隨機數表法將Wistar母鼠隨機分為空白組（生理鹽水）、缺乳模型組（溴隱亭）、陽性對照組（乳清蛋白鱸魚粉）、實驗組（鱘魚頭湯），每組6 只，對哺乳期Wistar母鼠進行連續14 d灌胃。

根據大鼠與正常人給藥量換算系數（6.3）、大鼠胃容積（0.9 mL/100 gmb）灌胃干預，按照大鼠與人體的受藥量公式換算每只大鼠的灌胃劑量。除空白組外，其余各組大鼠灌胃溴隱亭1.6 mg/kgmb，建立缺乳模型大鼠。實驗組大鼠同時灌胃1.05 g/kgmb鱘魚頭湯（鱘魚頭湯低溫凍干濃縮成粉狀，用蒸餾水配制0.5 g/mL鱘魚頭湯凍干粉溶液）；陽性對照組大鼠灌胃1.05 g/kgmb乳清蛋白鱸魚粉（用蒸餾水溶解，配制0.5 g/mL乳清蛋白鱸魚粉溶液）；空白組大鼠灌胃相同劑量的0.9 g/100 mL生理鹽水。

末次給藥后母鼠禁食、不禁水12 h，母鼠腹主動脈取血，收集血清，然后脊椎脫臼法處死母鼠，取乳腺組織，進行后續實驗探究。

1.3.3 乳腺相對質量測定

參考文獻[16-17]的方法，每只母鼠乳腺相對質量按式（1）計算。

1.3.4 泌乳量測定

從給藥日開始，每日上午10點稱量全窩10 只仔鼠總體質量，記為m1/g，然后將母鼠與仔鼠分籠4 h后，再次稱量整窩仔鼠體質量，記為m2/g，再將母鼠與仔鼠放在同一籠，在大鼠哺乳喂養1 h后稱量整窩仔鼠體質量，記為m3/g。母鼠每小時的泌乳量為母鼠對仔鼠哺乳1 h前后整窩仔鼠體質量之差與仔鼠每小時平均基礎代謝量的總和[18-19]，按式（2）計算。

1.3.5 仔鼠窩重凈增率測定

仔鼠窩重凈增率按式（3）計算。

式中：m14為灌胃第14天（末次給藥后）整窩仔鼠體質量/g；m0為灌胃第1天整窩仔鼠體質量/g。

1.3.6 母鼠乳腺組織病理觀察

在無菌手術下取第3對左側乳房，浸泡固定于體積分數10%甲醛溶液中。取出固定后的乳腺組織，使用常規石蠟包埋，切片，然后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色，采用光學顯微鏡，對母鼠乳腺組織進行病理組織學觀察。

1.3.7 免疫組化法檢測母鼠乳腺組織PRL、β-CN表達

采用二甲苯溶液對母鼠乳腺組織石蠟切片進行脫蠟處理，梯度乙醇溶液和蒸餾水清洗。將清洗后的乳腺組織切片置于盛有檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）的修復盒中，并將其放入微波爐，中火加熱4 次，每次5 min，用于修復抗原。修復后的組織切片置于體積分數3%過氧化氫溶液中室內避光孵育25 min后，蒸餾水洗滌5 min，共3 次。之后用3% BSA室溫封閉30 min后，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育50 min。再向切片加入DAB顯色液后水洗，蘇木素復染3 min后自來水沖洗并返藍。體積分數75%、85%乙醇溶液和無水乙醇梯度脫水（各5 min），正丁醇脫水5 min，二甲苯透明，中性樹膠密封片。采用光學顯微鏡觀察染色情況并拍照。

1.3.8 ELISA法檢測PRL、PRLR、β-CN、α-LA、LS、FAS水平

末次給藥后母鼠禁食、不禁水12 h，于次日上午大鼠下腹部注射質量分數10%水合氯醛溶液用于麻醉，腹主動脈取血，使用非抗凝真空采血管收集，4000 r/min離心15 min。取上清液放置于1.5 mL離心管中，于－80 ℃冰箱凍存。大鼠處死后迅速分離乳腺組織，取大小適宜的大鼠乳腺組織，加入生理鹽水用研磨珠研磨，制備10%的組織勻漿液，3000 r/min離心10 min，取上清液備用。

根據ELISA試劑盒說明書步驟，分別加入PRL、PRLR、β-CN、α-LA、LS和FAS一抗，37 ℃孵育1 h，棄去孔內液體并用洗液清洗3 次。各孔加入相應的HRP標記二抗孵育30 min，然后加入TMB顯色液于避光環境中繼續孵育30 min，最后加入終止液，用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度。計算血清與乳腺組織中PRL、PRLR，以及乳腺組織中β-CN、α-LA、LS和FAS的含量。

1.3.9 實時熒光定量PCR檢測乳腺組織中β-CN、α-LA及FAS基因表達水平

制備母鼠乳腺組織勻漿，提取RNA，然后稀釋RNA提取液至適宜濃度。對稀釋后RNA提取液進行反轉錄，每個產物配制3 管，進行PCR擴增。95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，循環40 次。定義空白組各基因表達水平為1，采用2－ΔΔCt法計算基因相對表達量。基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺相對質量的影響

如圖1所示，模型組大鼠乳腺相對質量較空白組顯著降低，而陽性組和鱘魚頭湯組乳腺相對質量相對于模型組顯著提高（P＜0.05），且與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），說明鱘魚頭湯組母鼠乳腺相對質量已基本恢復至正常水平。

圖1 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺相對質量的影響Fig.1 Effect of sturgeon head soup on mammary gland to body mass ratio in rats with postpartum hypogalactia

2.2 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠泌乳量的影響

如圖2所示，從灌胃第2天開始（除灌胃第8天），缺乳模型組母鼠的泌乳量較空白組顯著降低（P＜0.05），而鱘魚頭湯組泌乳量顯著高于缺乳模型組（P＜0.05），并持續至灌胃結束。整個灌胃期，空白組、陽性對照組和鱘魚頭湯組之間泌乳量總體無顯著差異（P＞0.05），說明在實驗灌胃14 d周期內，與空白組相比，模型組會明顯抑制泌乳量的增加；與模型組相比，陽性對照組和鱘魚頭湯組能夠促進大鼠泌乳，使泌乳量與對照組接近。

圖2 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠泌乳量的影響Fig.2 Effect of sturgeon head soup on milk productivity of rats with postpartum hypogalactia

2.3 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠的仔鼠窩重凈增率的影響

如圖3所示，缺乳模型組仔鼠窩重凈增率顯著低于空白組，與缺乳模型組相比，陽性對照組與鱘魚頭湯組仔鼠窩重凈增率顯著增加（P＜0.05），且空白組、陽性對照組及鱘魚頭湯組之間無顯著差異（P＞0.05），表明在灌胃14 d后缺乳模型組仔鼠體質量增長較少，陽性對照組及鱘魚頭湯組仔鼠體質量增率能夠恢復至正常水平。

圖3 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠的仔鼠窩重凈增率的影響Fig.3 Effect of sturgeon head soup on percent body mass gain of the whole litter of suckling rats

2.4 母鼠乳腺外觀與乳腺組織HE染色觀察結果

由圖4可知，空白組、陽性對照組和鱘魚頭湯組母鼠腹部皮膚更為飽滿充盈，剖開腹部皮層，鈍性分離腹部皮膚后，可以觀察到模型組的乳腺組織在胸腹部皮下分布較少，且呈現灰白色，無光澤。而鱘魚頭湯組胸腹部皮下有大量乳腺組織分布，腺體呈肉粉色，飽滿有光澤，乳腺外觀幾乎恢復至與空白組一致。

圖4 母鼠胸腹部皮下乳腺外觀Fig.4 Appearance of subcutaneous mammary glands in thorax and abdomen of female mice

如圖5所示，在低倍鏡視野下可明顯觀察到，與空白組相比，缺乳模型組母鼠的乳腺脂肪結締組織數量明顯增多，呈孔洞空白狀。在高倍鏡視野下可以看出，缺乳模型組母鼠腺泡數量稀少且不充盈，乳腺小葉分葉不明顯，乳腺呈萎縮狀，腺腔內分泌物數量明顯減少。而與缺乳模型組相比，陽性對照組和鱘魚頭湯組母鼠乳腺中結締組織和脂肪組織相對分布較少，有更多新發育的腺泡，腺泡呈圓形，小葉內腺泡大量增生，在腺管中可以看到有較多分泌物，乳腺小葉有較明顯的恢復。

圖5 母鼠皮下乳腺組織HE染色結果Fig.5 HE staining of subcutaneous mammary gland tissues of female rats

2.5 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺組織PRL、β-CN表達的影響

如圖6所示，免疫組化分析中PRL、β-CN蛋白呈棕黃色陽性顯色，多見于乳腺組織的分泌小葉內以及各腺泡組織和乳腺導管細胞處。與空白組相比，缺乳模型組的棕黃色區域較少，說明其PRL、β-CN蛋白表達量明顯減少；與缺乳模型組比較，鱘魚頭湯組PRL、β-CN蛋白表達量明顯增多。空白組、陽性對照組和鱘魚頭湯組PRL、β-CN蛋白表達量無明顯差異。這與楊亞潔等[20]研究結果一致。

圖6 母鼠乳腺中PRL、β-CN蛋白表達的免疫組化染色圖Fig.6 Immunohistochemical staining of PRL and β-CN protein expression in the mammary gland of female rats

2.6 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠血清與乳腺中激素水平和相關乳蛋白表達的影響

2.6.1 血清和乳腺中PRL、PRLR水平

泌乳過程受生理、心理和激素調節的共同作用，是較為復雜的生理過程，其中PRL是泌乳過程中的一種主要激素[20-21]。PRL是一種單鏈多肽類激素，對哺乳動物乳腺組織的生長、發育、分化以及乳汁的生成具有調節作用，用于動物產后泌乳的啟動和維持[22]。產后泌乳中乳腺受到腦垂體分泌的PRL調節，而體內PRL激素水平降低往往是導致產后缺乳的重要原因[23]。PRL隨血液循環進入乳腺組織并與乳腺組織中的PRLR結合，從而發揮生物效應，共同刺激乳腺泌乳[24]。在乳腺上皮細胞以及基質細胞中均有PRLR表達，在妊娠和哺乳期過程中乳腺也在不斷發育，期間PRLR的表達水平逐漸增加[25]。PRLR表達量的增加可以為PRL提供充足的結合位點，更好地促進泌乳。

本實驗采用甲磺酸溴隱亭降低產后大鼠PRL激素水平，減少其乳汁分泌，以構建缺乳大鼠模型[26]。為進一步明確鱘魚頭湯改善產后缺乳大鼠泌乳的機制，測定產后大鼠乳腺與血清中PRL與PRLR水平。由圖7可知，模型組大鼠乳腺與血清中PRL與PRLR水平均較空白組顯著減少（P＜0.05），而陽性組和鱘魚頭組大鼠乳腺與血清中PRL與PRLR水平相對模型組顯著增加（P＜0.05），且鱘魚頭湯組與陽性對照組效果相似，均與正常組無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺與血清中PRL（A）、PRLR（B）水平的影響Fig.7 Effect of sturgeon head soup on the levels of PRL (A) and PRLR(B) in the mammary gland and serum of rats with postpartum hypogalactia

2.6.2 乳腺中乳蛋白及乳糖、乳脂合成酶含量

乳蛋白主要包括酪蛋白以及乳清蛋白等，是評價乳品質的重要依據。β-CN是酪蛋白中的一種，由乳腺腺泡上皮細胞產生[27]，其含量占乳蛋白總量的30%～35%[28-29]，且蛋白結構相對穩定。研究表明β-CN的合成與分泌可表征乳腺細胞泌乳功能[30-31]。由圖8A可知，與空白組比較，缺乳模型組大鼠乳腺組織中β-CN和α-LA含量均顯著降低（P＜0.05）；與產后缺乳模型組比較，鱘魚頭湯組大鼠乳腺組織中β-CN、α-LA含量均顯著增加（P＜0.05）。這說明鱘魚頭湯不僅能夠提高泌乳量，也能夠促進乳汁中乳蛋白的分泌，提高乳汁質量。

乳糖是一種乳汁特異性碳水化合物，在哺乳期由乳腺上皮細胞合成[32]，其含量可直接反映乳汁的質量。乳脂也是乳汁中的一個重要組分，其產生過程如下：首先，合成乳中脂肪酸，其中一部分乳脂肪酸通過乳腺血液循環攝入，然后由乳腺中的短中鏈脂肪酸合成[33]，還有一部分乳脂肪酸是乳腺上皮細胞在脂肪酸合成酶作用下，利用乙酸和β-羥基丁酸從頭合成鏈長小于C16的脂肪酸及占比約50%的C16脂肪酸[34]；然后，合成甘油三酯，從頭合成或外源攝取的脂肪酸在乳腺上皮細胞內質網上通過相關調控酶合成甘油三酯主鏈；最后，在乳腺細胞內質網中甘油三酯等中性脂質合成脂滴，隨著脂滴的匯聚并移動到頂膜，經乳腺上皮細胞以乳脂肪球的形式分泌到乳中[35]。因此，LS、FAS對乳汁的營養至關重要。

由圖8B可知，相比空白組，模型組乳腺組織中LS、FAS含量均顯著降低（P＜0.05），而鱘魚頭湯組LS、FAS含量相對模型組顯著升高，并與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

圖8 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺中β-CN、α-LA、LS與FAS含量的影響Fig.8 Effect of sturgeon head soup on the contents of β-CN,α-LA,LS and FAS in the mammary gland of rats with postpartum hypogalactia

2.7 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺中乳蛋白和乳脂相關基因表達的影響

乳腺是蛋白質、脂肪等物質合成的重要場所，其通過一系列生物化學過程合成并分泌乳汁[36]。乳汁中包含許多的營養成分，乳腺上皮細胞從血液中吸收營養物質并將其轉化為乳蛋白、乳脂等并分泌到腺泡中[37]。通過檢測乳腺組織中的相關乳蛋白、乳脂基因的表達水平，驗證分泌乳汁的質量。如圖9所示，與模型組相比，鱘魚頭湯組中控制乳蛋白合成基因β-CN、α-LA以及乳脂合成相關基因FAS表達水平顯著上調（P＜0.05），且顯著高于空白組和陽性對照組；陽性對照組雖也有所上調，但顯著低于鱘魚頭湯組（P＜0.05）。說明鱘魚頭湯促進缺乳大鼠泌乳的功效機制可能與其促進乳腺組織中β-CN、α-LA及FAS基因表達有關。

圖9 鱘魚頭湯對產后缺乳大鼠乳腺中β-CN（A）、α-LA（B）與FAS（C）mRNA表達量的影響Fig.9 Effect of sturgeon head soup on the mRNA expression of β-CN (A), α-LA (B) and FAS (C) in the mammary gland of rats with postpartum hypogalactia

3 結論

鱘魚頭湯具有顯著增加產后缺乳大鼠泌乳量的作用，實驗結果證實鱘魚頭湯具有促進泌乳的功效；推測其可能作用機理是鱘魚頭湯提高了大鼠血清中PRL水平，促進乳腺組織中PRL和β-CN蛋白表達，還可提高乳腺組織β-CN、α-LA以及FAS基因表達，可能與鱘魚頭中含有催乳素[12]有關。本研究表明鱘魚頭湯具有良好的治療缺乳功效，為食療催乳的研究提供了參考。此外，鱘魚頭湯可作為一種功能性食品，其不含藥物成分，具有較高的安全性，降低了產婦因服用藥物催乳導致的不良反應，并減少了傳統中藥湯劑熬制過程繁瑣與味苦難以下咽的缺陷。未來可進一步探究鱘魚頭湯促進泌乳的作用是否與鱘魚頭部（腦垂體）的催乳素相關，及其進入體內具體作用靶點和相關調控分子機制。