南美白對(duì)蝦響應(yīng)急冷與無(wú)水暴露雙重脅迫的生理變化特征

劉 澂，吳嘉鑫,2，徐德峰,2,3,*，孫力軍,2，秦小明,2，范秀萍,2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；3.大連工業(yè)大學(xué) 精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

近年來(lái)隨著消費(fèi)者對(duì)鮮活水產(chǎn)需求的快速增加，保活流通技術(shù)成為研究熱點(diǎn)[1-3]。目前鮮活水產(chǎn)品的保活流通以有水方式為主，但較低的裝載密度及對(duì)水質(zhì)清潔度的較高要求使得綜合運(yùn)輸成本偏高。相比而言，基于生態(tài)冰溫誘導(dǎo)休眠的微水或無(wú)水保活流通技術(shù)則極大降低了運(yùn)輸過(guò)程中鮮活水產(chǎn)品的應(yīng)激反應(yīng)，可顯著增加裝載密度，降低單位運(yùn)輸成本，并通過(guò)控制代謝強(qiáng)度來(lái)消減溶氧、二氧化碳、氨氮等環(huán)境因素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物存活的不利影響[4-6]，因而無(wú)水保活運(yùn)輸相較于有水活體運(yùn)輸具有更廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）是當(dāng)今全球最重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類之一，其無(wú)水保活流通具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[7]。雖然近年來(lái)水產(chǎn)動(dòng)物無(wú)水保活技術(shù)研究日漸增多，設(shè)備逐漸多樣化[8-10]，但目前對(duì)蝦無(wú)水保活流通作業(yè)缺乏低溫預(yù)冷過(guò)程，通常是直接將養(yǎng)殖塘中的對(duì)蝦捕撈后投放于用冰塊預(yù)冷至12～15 ℃的低溫水體中，短時(shí)間內(nèi)使其強(qiáng)迫進(jìn)入半休眠或休眠狀態(tài)，之后短途運(yùn)輸至特定流通場(chǎng)所，低溫環(huán)境下將休眠態(tài)對(duì)蝦裝入聚乙烯袋，充氧密封后存放在內(nèi)置冰袋的航空運(yùn)輸泡沫箱內(nèi)，經(jīng)紙箱外包裝后快速運(yùn)至附近機(jī)場(chǎng)，利用航空運(yùn)輸?shù)乃俣葍?yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離的快速保活流通。但該作業(yè)流程存在初期低溫急冷（acute cold exposure，AC）和中途無(wú)水空氣暴露（waterless duration，WD）雙重脅迫（AC＋WD），必然對(duì)對(duì)蝦個(gè)體存活質(zhì)量造成影響，使得目前南美白對(duì)蝦無(wú)水保活流通過(guò)程中應(yīng)激性傷殘死亡率高達(dá)20%～30%[3,10-11]。因此，迫切需要探明無(wú)水保活流通過(guò)程中南美白對(duì)蝦響應(yīng)AC＋WD雙重脅迫的生理生化機(jī)制，識(shí)別關(guān)鍵生化標(biāo)志物和響應(yīng)途徑，從而靶向控制傷殘死亡率和提升存活質(zhì)量。

代謝是維持細(xì)胞存活的基本方式，其中物質(zhì)和能量代謝平衡是細(xì)胞存活的關(guān)鍵，而糖代謝途徑和關(guān)鍵酶活力直接決定了細(xì)胞能量水平和代謝中間產(chǎn)物的細(xì)胞毒性，最終決定細(xì)胞存活與否[12-14]。此外，環(huán)境脅迫會(huì)引起水產(chǎn)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，為維持正常的生理狀態(tài)，水產(chǎn)動(dòng)物會(huì)從神經(jīng)內(nèi)分泌、生理生化、免疫調(diào)節(jié)等層面協(xié)同調(diào)節(jié)以適應(yīng)環(huán)境脅迫[4]。長(zhǎng)時(shí)間低溫?zé)o水保活流通對(duì)加州鱸魚（Micropterus salmonids）[15]、蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）[16]、縊蟶（Sinonovacula constricta）[17]細(xì)胞能量代謝的影響已有報(bào)道；且研究發(fā)現(xiàn)廣溫性魚類暴露于低溫水環(huán)境時(shí)可調(diào)節(jié)代謝酶活力并改變代謝途徑，從而使其代謝和生理活動(dòng)適應(yīng)環(huán)境變化[18]。然而，目前尚不清楚無(wú)水保活流通過(guò)程中南美白對(duì)蝦對(duì)AC＋WD雙重脅迫的代謝應(yīng)答響應(yīng)規(guī)律。此外，肝胰腺作為對(duì)蝦重要生理活動(dòng)執(zhí)行器官，在物質(zhì)代謝、環(huán)境響應(yīng)和免疫防護(hù)方面發(fā)揮重要作用。因此，結(jié)合血液和肌肉組織生化指標(biāo)變化，系統(tǒng)分析肝胰腺在南美白對(duì)蝦無(wú)水保活流通過(guò)程中的生化代謝和組織特征變化，有助于揭示南美白對(duì)蝦響應(yīng)AC＋WD雙重脅迫的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，為優(yōu)化南美白對(duì)蝦無(wú)水保活運(yùn)輸管理、提升存活質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 kg南美白對(duì)蝦（個(gè)體質(zhì)量（17.23f 1.12）g、體長(zhǎng)（7.56f 0.42）cm）購(gòu)于廣東省湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，隨機(jī)均分5 份裝于20 L聚乙烯袋中，每袋裝有10 L海水，水體充氧后在1 h內(nèi)運(yùn)回廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院保活流通實(shí)驗(yàn)室。之后迅速將對(duì)蝦置于1 m3新鮮海水（水溫（23f 1）℃、pH（7.69f 0.5））中，于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下適應(yīng)性暫養(yǎng)12 h，增氧泵連續(xù)曝氣，不投放餌料，中途清潔海水換水一次。然后隨機(jī)挑選無(wú)機(jī)械性損傷、狀態(tài)良好的對(duì)蝦進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

檸檬酸、葡萄糖、氯化鈉、檸檬酸三鈉、乙二胺四乙酸二鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、甲醛、冰醋酸（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、Na＋/K＋-ATPase活力檢測(cè)試劑盒以及葡萄糖（glucose，Glu）、乳酸（lactic acid，LD）、糖原（glycogen，Gn）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、蛋白質(zhì)含量檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan全自動(dòng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；5810R多功能臺(tái)式離心機(jī) 艾本德（中國(guó)）有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇朗博儀器制造有限公司；LTI-700W低溫恒溫培養(yǎng)箱 上海愛朗儀器有限公司；7002超低溫冰箱 美國(guó)熱電公司；S20供氧機(jī)寧波塞爾電氣公司；層析柜 上海博迅儀器股份有限公司；塑料周轉(zhuǎn)箱 東莞市茶山中距塑膠卡板廠。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)蝦分組與脅迫處理

參照徐德峰等[19]的方法，預(yù)先準(zhǔn)備3 個(gè)塑料周轉(zhuǎn)箱（490 mmh 345 mmh 285 mm）并連續(xù)編號(hào)，每箱分別注入20 L新鮮海水，將暫養(yǎng)后挑選的360 尾南美白對(duì)蝦隨機(jī)分為3 組，每組120 尾。將放入1號(hào)箱（24 ℃）中的對(duì)蝦作為正常對(duì)照（normal control，NC）組。2號(hào)和3號(hào)箱使用全自動(dòng)循環(huán)冷水機(jī)將水溫降至對(duì)蝦生態(tài)冰溫休眠溫度（12f 1）℃，將其余兩組對(duì)蝦分別放入2號(hào)和3號(hào)箱中進(jìn)行AC處理誘導(dǎo)休眠，2號(hào)箱對(duì)蝦在休眠30 min后取出，作為單獨(dú)急冷脅迫組（AC組）。觀察3號(hào)箱中對(duì)蝦活動(dòng)狀態(tài)，至側(cè)倒、游泳足擺動(dòng)無(wú)規(guī)律、機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)后撈出，模擬南美白對(duì)蝦無(wú)水保活低溫流通環(huán)境[20]，分裝于塑料自封袋中（每袋10 尾），鑒于無(wú)水環(huán)境下機(jī)體易發(fā)生組織缺氧，故充入純度99.5%的氧氣后密封，然后置于12 ℃層析柜保存，作為AC＋WD雙重脅迫組，取第3、6、9小時(shí)，以及9 h后放入自然水溫（25 ℃）復(fù)蘇2 h的對(duì)蝦樣品，分別記為AC＋WD3h、AC＋WD6h、AC＋WD9h、AC＋WD9h＋R組。以NC和AC組為對(duì)照，分別在不同時(shí)間點(diǎn)取血淋巴、肝胰腺和肌肉組織，檢測(cè)相關(guān)代謝生化指標(biāo)，并進(jìn)行肝胰腺組織病理分析。

1.3.2 血淋巴、肝胰腺、肌肉組織樣品制備及代謝指標(biāo)測(cè)定

血淋巴的采集：參照彭迪等[20]的方法用1 mL無(wú)菌注射器，按照血與抗凝劑體積比1∶1的比例，從對(duì)蝦腹血竇中采集血淋巴于1.5 mL離心管中，4 ℃、3000 r/min離心10 min取上清液，立即進(jìn)行測(cè)定或于－80 ℃下凍存。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清Glu、LD濃度和PK、PFK、HK、SDH、LDH活力。

肝胰腺組織勻漿液的制備：參照J(rèn)ia Xuying等[21]的方法，在各時(shí)間點(diǎn)將對(duì)蝦放于冰盤上迅速解剖取肝胰腺，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%的生理鹽水沖洗后，冰上高速勻漿制備10%組織勻漿液，4 ℃、5000 r/min離心20 min后取上清液，立即進(jìn)行測(cè)定或－80 ℃凍存。嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)肝胰腺中Gn、LD含量和HK、PK、PFK、SDH、LDH、Na＋/K＋-ATPase活力。除Gn含量外，各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均以蛋白質(zhì)量計(jì)。

肌肉組織勻漿液的制備：對(duì)蝦剝殼后取第二腹節(jié)處肌肉0.5 g，冰上高速組織勻漿制備10%組織勻漿液，4 ℃、5000 r/min離心20 min后取上清液，立即進(jìn)行測(cè)定或－80 ℃凍存。嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)肌肉Gn、ATP含量和Na＋/K＋-ATPase活力。Na＋/K＋-ATPase活力測(cè)定結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.3 肝胰腺組織病理分析

按照本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)方法[22]，對(duì)各組對(duì)蝦肝胰腺組織進(jìn)行石蠟組織切片制備及結(jié)構(gòu)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)均平行測(cè)定3 次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行多重比較，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦糖代謝的影響

以Glu為代表的糖類是生物能量的重要來(lái)源，而糖酵解途徑則是所有生物細(xì)胞進(jìn)行糖分解代謝的共有途徑。AC＋WD雙重脅迫后血清Glu濃度顯著高于NC對(duì)照組（P＜0.05），隨著雙重脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Glu 濃度呈先升高后降低趨勢(shì)，AC ＋WD 6 h 組最高，為（26.31 f1.05）mmol/L，復(fù)蘇后Glu 濃度為（23.92f 0.59）mmol/L（圖1A）。無(wú)氧條件下Glu糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸會(huì)在LDH催化下產(chǎn)生LD。由圖1B可知，血清、肝胰腺和肌肉組織中LD含量在冷脅迫后均高于NC組，雙重脅迫下南美白對(duì)蝦血清和肌肉中LD水平顯著上升（P＜0.05）；9 h時(shí)血清、肝胰腺和肌肉組織中LD 水平分別為（7.90 f 0.11）mmol/L、（0.12f 0.03）mmol/g和（0.52f 0.02）mmol/g，明顯高于其他各組，復(fù)蘇后血清中LD 含量降至（6.27f 0.32）mmol/L，提示脅迫進(jìn)程中南美白對(duì)蝦組織缺氧逐漸加重。Gn是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的儲(chǔ)存形式，能夠滿足細(xì)胞應(yīng)激時(shí)對(duì)能量的需求。由圖1C可知，AC＋WD雙重脅迫后南美白對(duì)蝦肝胰腺和肌肉組織中Gn含量均連續(xù)下降，在9 h時(shí)肝胰腺和肌肉組織中Gn含量分別降至（4.48f 0.31）mg/g和（1.43f 0.14）mg/g，均顯著低于NC組（P＜0.05），復(fù)蘇后肌肉中Gn含量顯著回升至（1.74f 0.10）mg/g（P＜0.05），提示雙重脅迫下Gn分解代謝增強(qiáng)，可能源于應(yīng)激條件下Gn生成Glu以維持機(jī)體能量供給穩(wěn)定。Glu、LD和Gn水平變化表明AC＋WD雙重脅迫破壞了南美白蝦細(xì)胞糖代謝平衡。

圖1 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦血清、肝胰腺和肌肉組織中Glu（A）、LD（B）和Gn（C）水平的影響Fig.1 Effects of combined stress of AC and WD on the concentrations of Glu (A),LD (B) and Gn (C) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.2 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦呼吸代謝途徑的影響

SDH作為三羧酸循環(huán)中唯一鑲嵌在線粒體內(nèi)膜上的酶，連接氧化磷酸化和電子轉(zhuǎn)移，其活性變化影響氧化磷酸化的進(jìn)行，是有氧呼吸的標(biāo)志酶[23-24]。由圖2A可以看出，AC＋WD雙重脅迫后AC＋WD3h組血清、肝胰腺和肌肉中SDH活力均較NC組有不同程度的增加，且脅迫3 h后分別為（2.36f 0.13）U/mL、（360.39f 15.48）U/g和（32.90f 0.89）U/g，明顯高于其他組，表明雙重脅迫組初期有氧呼吸較NC組增強(qiáng)，3 h后各組織中SDH活力逐漸下降，血清中SDH活力在9 h降至（1.61f 0.10）U/mL，復(fù)蘇后回升且略高于NC 對(duì)照組，肝胰腺和肌肉中SDH活力在復(fù)蘇后分別降至（277.24f 8.91）U/g和（25.00f 1.36）U/g，均低于NC組。SDH活力變化表明雙重脅迫3 h后細(xì)胞開始由有氧代謝轉(zhuǎn)為無(wú)氧代謝。

LDH是細(xì)胞內(nèi)糖酵解和無(wú)氧呼吸的關(guān)鍵酶，能夠促進(jìn)丙酮酸向乳酸轉(zhuǎn)化，常被用作反映細(xì)胞無(wú)氧代謝的重要指標(biāo)[25]。由圖2B可以看出，血清中LDH活力變化趨勢(shì)與SDH活力類似，在雙重脅迫3 h后LDH活力達(dá)到最高，為（53.06f 2.11）U/L，顯著高于其他組（P＜0.05），而肝胰腺和肌肉中LDH活力在脅迫進(jìn)程中呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且雙重脅迫9 h時(shí)LDH活力分別增至（0.43f 0.02）×103U/g和（5.21 f 0.20）×103U/g，顯著高于其他組（P＜0.05），復(fù)蘇后LDH活力降至NC組水平，進(jìn)一步表明南美白對(duì)蝦無(wú)水保活過(guò)程中細(xì)胞由有氧呼吸逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸，復(fù)蘇后又轉(zhuǎn)為有氧呼吸。

圖2 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦血清、肝胰腺和肌肉組織SDH（A）和LDH（B）活力的影響Fig.2 Effects of combined stress of AC and WD on the activities of SDH (A) and LDH (B) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.3 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦糖酵解進(jìn)程的影響

HK、PFK和PK為糖酵解途徑的限速酶，其活力變化反映了糖酵解的速率，其中在糖酵解的第一個(gè)限速步驟中，HK將Glu轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸。由圖3A可以看出，HK活力在脅迫期間整體呈先升高后降低趨勢(shì)，血清、肝胰腺和肌肉中HK活力均在3 h達(dá)到最高值，分別為（14.29f 1.21）U/mL、（2.14f 0.12）×103U/g和（0.52 f 0.07）×103U/g，顯著高于其他組（P＜0.05），之后開始下降，且在9 h肝胰腺和肌肉中分別降至（1.52f 0.08）×103U/g和（0.39f 0.03）×103U/g，復(fù)蘇后肝胰腺和肌肉中HK活力回升至NC組水平，表明糖酵解在前3 h較強(qiáng)，之后糖酵解速率下降。

PFK是一種變構(gòu)酶，其催化效率較低，糖酵解速率嚴(yán)格依賴該酶的活力水平，且H＋濃度對(duì)該酶有抑制作用，因此乳酸積累可反饋抑制PFK活力，同時(shí)PFK活力也受高濃度ATP抑制[24-26]。由圖3B可知，血清和肌肉中PFK活力在AC＋WD雙重脅迫3 h時(shí)分別增至（101.54f 3.91）U/L和（86.50f 2.41）U/g，高于其他組，之后逐漸下降，9 h時(shí)分別降至（81.08f 7.22）U/L和（43.55f 3.10）U/g，復(fù)蘇后回升至NC組水平；肝胰腺中PFK活力也呈類似變化趨勢(shì)，說(shuō)明糖酵解途徑受到抑制。

PK在ATP合成過(guò)程中起決定作用，因此在細(xì)胞能量代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[27]。由圖3C可知，PK活力在脅迫進(jìn)程中均呈先升高后降低趨勢(shì)，但AC組血清和肝胰腺中PK活力最高，分別為（6.45f 0.32）U/L和（12374.04f 0.89）U/g，而肌肉中PK活力為AC＋WD3h組最高，之后各組織中PK活力逐漸下降，9 h時(shí)血清、肝胰腺和肌肉PK活力均達(dá)到最低點(diǎn)，復(fù)蘇后均回升至接近NC組水平。HK、PFK和PK活力變化綜合反映了AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦糖酵解進(jìn)程產(chǎn)生顯著影響，尤其是在脅迫后期顯著抑制了糖酵解的進(jìn)行。

圖3 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦血清、肝胰腺和肌肉組織中HK（A）、PFK（B）和PK（C）活力的影響Fig.3 Effects of combined stress of AC and WD on the activities of HK (A),PFK (B) and PK (C) in hemolymph,hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.4 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦能量水平的影響

Na＋/K＋-ATPase亦稱鈉鉀泵，通過(guò)消耗ATP維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，同時(shí)可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞中糖和氨基酸的運(yùn)送以調(diào)節(jié)細(xì)胞體積[7,12,27]。由圖4A可知，AC脅迫后，肝胰腺和肌肉中Na＋/K＋-ATPase活力較NC組顯著增加（P＜0.05），分別為（1629.28f 71.31）U/g和（1082.21f 62.89）U/g，而在AC＋WD脅迫進(jìn)程中肝胰腺和肌肉Na＋/K＋-ATPase活力均呈下降趨勢(shì)，AC ＋WD 9 h 組下降至（1111.80f 64.87）U/g和（750.19f 38.39）U/g，復(fù)蘇后回升至接近NC組水平，可能是由于初期的急冷脅迫刺激Na＋/K＋-ATPase表達(dá)，而在AC＋WD的低溫環(huán)境下酶活力明顯受到抑制。此外，如圖4B所示，肌肉中ATP含量在AC＋WD脅迫后較NC組逐漸下降，AC＋WD9h組降至最低（4.02f 0.21）μmol/g，顯著低于其他組（P＜0.05），復(fù)蘇后雖顯著回升至（4.88f 0.31）μmol/g，但仍顯著低于NC組（P＜0.05），提示脅迫進(jìn)程中因細(xì)胞膜滲透性改變而內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，為維持內(nèi)環(huán)境平衡，細(xì)胞通過(guò)增加ATP消耗來(lái)加快細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)輸送，以維持細(xì)胞內(nèi)的滲透壓平衡。

圖4 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺和肌肉組織中Na＋/K＋-ATPase活力（A）和肌肉ATP含量（B）的影響Fig.4 Effects of combined stress of AC and WD on Na+/K+-ATPase activity (A) and ATP content (B) in hepatopancreas and muscle tissues of Penaeus vannamei

2.5 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺組織病理結(jié)構(gòu)的影響

甲殼動(dòng)物的肝胰腺中含分泌細(xì)胞（B細(xì)胞）、吸收細(xì)胞（F細(xì)胞）、儲(chǔ)存細(xì)胞（R細(xì)胞）和胚細(xì)胞（E細(xì)胞），成年商品對(duì)蝦肝胰腺中以B細(xì)胞和R細(xì)胞為主，且環(huán)境應(yīng)激會(huì)對(duì)細(xì)胞比例造成影響[28-29]。由圖5可以看出，NC組對(duì)蝦肝胰腺肝小管輪廓清晰，其中細(xì)胞形態(tài)正常且分布均勻，管腔形狀規(guī)則，轉(zhuǎn)運(yùn)泡整體數(shù)量不多且在細(xì)胞內(nèi)分布較為均勻；AC組管腔形態(tài)仍較為規(guī)則，但體積略有增大，基膜收縮，表明急冷脅迫對(duì)細(xì)胞組織有輕微損傷。AC＋WD脅迫3 h時(shí)空泡數(shù)量相較于NC組明顯增加，B細(xì)胞數(shù)量減少，肝小管形狀的空泡擠壓性變形加重；AC＋WD脅迫6 h時(shí)空泡數(shù)量明顯減少，但體積變大，且管腔體積進(jìn)一步加大；AC＋WD脅迫9 h時(shí)大空泡數(shù)量增多，管腔被明顯擠壓變形，且管腔中細(xì)胞數(shù)量明顯減少，破碎細(xì)胞組織數(shù)量增多，提示細(xì)胞發(fā)生了明顯降解或凋亡。復(fù)蘇組（AC＋WD9h＋R）中管腔仍有明顯破損，但較AC＋WD6h和AC＋WD9h組明顯減輕，空泡體積減小但數(shù)量明顯增加，與AC＋WD3h組的組織形態(tài)特征類似，表明細(xì)胞損傷得到一定程度的修復(fù)。

圖5 AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺病理結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of combined stress of AC and WD on the histopathology of the hepatopancreas tissue of Penaeus vannamei

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬南美白對(duì)蝦無(wú)水保活流通作業(yè)，探究12 ℃ AC＋WD雙重脅迫對(duì)南美白對(duì)蝦代謝和組織結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)脅迫進(jìn)程中伴隨著SDH和LDH活力的變化，細(xì)胞呼吸由有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧呼吸，能量獲取方式發(fā)生改變，同時(shí)糖酵解過(guò)程的限速酶HK、PFK和PK活力在AC＋WD雙重脅迫3 h后整體下降，使能量發(fā)生明顯虧損，進(jìn)而導(dǎo)致血糖和乳酸積累，以及糖原含量持續(xù)下降，最終使細(xì)胞內(nèi)代謝穩(wěn)態(tài)失衡，為維持和恢復(fù)細(xì)胞代謝平衡，機(jī)體能量消耗增加，進(jìn)一步使ATP含量持續(xù)下降，最終因能量虧損而誘導(dǎo)組織損傷。