甘草查爾酮膠囊質量標準研究*

孫 宇，賈智超，張 娟，徐曉琴，卿德剛△

1 新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；

2 烏魯木齊市中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000

脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBatal.）為多年生草本，具有重要的藥用價值，近年研究表明，甘草查爾酮類化合物為脹果甘草特色化合物，在其他種類甘草如烏拉爾甘草、光果甘草中未見含有或含量較少［1-5］。甘草查爾酮類化合物不僅具有抑菌、抗真菌、抗氧化活性，其對HIV病毒和某些癌細胞的抑制作用甚至超過了甘草三萜類物質；甘草查爾酮也具有抑制癌細胞生長作用［6-8］。本研究在承擔國家自然科學基金項目已完成甘草查爾酮提取工藝研究及治療潰瘍性結腸炎藥理藥效實驗的基礎上，進一步對甘草查爾酮提取物的膠囊制劑進行質量標準研究。近年使用發現，僅參照藥典標準（含量測定為甘草苷和甘草酸銨）不便于區分各種甘草，有時會導致使用過程中出現質量差異性問題［9-10］，尤其在甘草黃酮或查爾酮類制品的鑒別及含量測定方面。本研究以前期進行的脹果甘草化學成分分離為基礎，篩選特征性成分并建立甘草查爾酮膠囊薄層鑒別及含量測定方法，以期為甘草查爾酮膠囊質量控制提供依據，為甘草查爾酮類物質的新藥研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器Waters e2695高效液相色譜儀；Waters 2998PDA檢測器；色譜柱：Waters XTerra RP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Mettler AE163電子天平；KQ3200型超聲波清洗儀；乙腈為色譜純；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試藥甘草查爾酮A對照品購自上海源葉生物科技有限公司，含量≥98%（CAS號：58749-22-7，批號：20190605001）；甘草查爾酮膠囊供試品3批（20190510、20190511、20190512）及陰性樣品（僅由輔料制備而成）均由新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所提供。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品及對照品溶液制備 取甘草查爾酮膠囊內容物0.02 g，加丙酮10 mL，超聲提取15 min，放冷，濾過，提取2次，合并丙酮液，蒸干，殘渣加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取甘草查爾酮A對照品，用甲醇配制成每毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 薄層板活化 將硅膠G薄層板于105 ℃烘箱中干燥30 min，取出放入干燥器中備用。

2.1.3 薄層層析 按照《中華人民共和國藥典》2020版四部0502薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液3 μL，對照品溶液3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以丙酮-異丙醇-甲苯-水-氨水（20∶6∶6∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干。日光下檢視后置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中在對照品相應的位置上顯相同斑點，陰性對照無干擾。見圖1—2。

圖1 甘草查爾酮膠囊薄層色譜圖（日光）

圖2 甘草查爾酮膠囊薄層色譜圖（紫外燈365 nm）

2.2 甘草查爾酮A含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTerra RP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1%磷酸溶液（58∶42）；流速：l.0 mL/min；檢測波長：310 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取甘草查爾酮A對照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取甘草查爾酮膠囊內容物約0.85 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，精密稱重，超聲處理30 min，冷卻后用甲醇補充減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

圖3 甘草查爾酮膠囊及甘草查爾酮A對照品色譜圖

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取濃度為2.5 mg/mL的對照品儲備液各0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液。每次取10 μL依次進樣，測定峰面積。以質量濃度（X）為橫坐標，色譜峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得甘草查爾酮A回歸方程Y=9635.2X+5.8384（r=0.9999）。結果表明甘草查爾酮A在0.05125～0.5125 mg范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按“2.2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，計算得RSD值為0.57%。

2.2.6 重現性試驗 取同一批樣品6份，制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定含量，結果甘草查爾酮A的平均值為4.4839 mg/g，RSD為1.47%。

2.2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液分別在制備后0、1、2、4、8、12 h時進樣測定，測得甘草查爾酮A峰面積RSD為1.54%，表明供試品在12 h內穩定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入一定量對照品，按“2.2.3”項制備供試品溶液，取續濾液10 μL進樣，計算回收率，RSD為1.62%。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2.9 樣品含量測定 分別取本品內容物約1 g，精密稱定，按“2.2.3”項制備供試品溶液，取續濾液10 μL進樣，按“2.2.1”項色譜條件測定，見表2。

表 2 樣品含量測定結果（n=9） mg/g

3 討論

在甘草查爾酮A薄層鑒別實驗中，常見的文獻方法對展開劑的選擇較多，有以丙酮-氯仿（4∶6）及環己烷-乙酸乙酯（5∶9）作為展開劑［11］等多種方法，本研究通過反復對比，發現以丙酮-異丙醇-甲苯-水-氨水（20∶6∶6∶3∶1）為展開劑時分離度良好，陰性無干擾。

在樣品的處理過程中，分別采用了甲醇回流提取法、甲醇超聲提取法、丙酮超聲提取法等方法進行提取，發現使用甲醇超聲提取法效果好，而且雜質干擾較小。在提取的過程中考察了超聲時間和甲醇體積分數對試驗結果的影響，發現超聲提取30 min效果優于10、20 min［12-13］。

甘草查爾酮A屬于黃酮類物質，通過PDA檢測器得到其以甲醇為溶劑時的紫外最大吸收波長為310 nm，故選擇紫外檢測波長為310 nm。

近年，由于國內外對甘草中黃酮類物質尤其是查爾酮類物質的深入研究，使得這類物質的醫院制劑及新藥產品不斷涌現，但在使用過程中發現，有些產品參照藥典標準（含量測定為甘草苷和甘草酸銨）或靠重量法、總黃酮測定法進行質量控制，導致使用過程中出現質量差異性問題（研究表明烏拉爾甘草和光果甘草中查爾酮類物質含量很低）［9-10］。

本研究建立了甘草查爾酮膠囊的薄層鑒別方法和甘草查爾酮A含量測定方法，結果表明，該方法簡單，準確，重現性良好，靈敏度高，可為該藥物質量控制的建立提供依據，也為全面研究及開發甘草查爾酮類藥物提供參考。