胎盤血管生成異常致復發性自然流產及其中醫藥治療的研究進展*

姚偉潔，馮 欣

首都醫科大學附屬北京婦產醫院北京婦幼保健院，北京 100006

復發性自然流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠的常見并發癥之一，我國通常將妊娠28周前3次及以上胎兒丟失稱為RSA，其發生率為15%～25%，且復發風險隨流產次數的增加而上升。RSA的病因復雜，妊娠12周以前RSA的病因多為遺傳因素、內分泌異常、生殖免疫功能紊亂及血栓前狀態等，12周至28周出現RSA主要為血栓前狀態、感染、妊娠附屬物異常和嚴重的先天性異常等［1］。目前針對RSA的治療主要通過手術糾正子宮解剖結構異常，通過葉酸、肝素及阿司匹林等藥物改善母體高凝狀態，或通過誘導產生封閉抗體從而抑制母嬰間的免疫排斥。

有研究發現，滋養層細胞功能缺陷導致的血管生成異常被認為是RSA最重要的原因之一，通過調節滋養層細胞增殖、遷移和侵襲來促進胎盤血管生成，可以作為治療RSA有效方法之一［2］。血管生成因子和微小核糖核酸（Micro RNA， miRNA）是影響血管生成的關鍵因素。此外有研究發現，外泌體具有重要的血管生成調控作用［3］，外泌體能夠將信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）、miRNA和蛋白質等物質傳遞給受體細胞，進行細胞間的通訊，從而改善血管生成以維持正常妊娠。

中藥治療RSA具有獨特優勢，而且取得了較好療效，其現代研究也發現中藥復方能通過調控血管生成而對RSA發揮治療作用。本文對影響RSA胎盤血管生成的血管生成因子、miRNA以及外泌體在血管生成中的調控作用進行綜述，并闡述中藥復方通過調控血管生成治療RSA的現狀，為中藥復方治療RSA提供新思路。

1 血管生成異常參與了多種疾病的發生

血管生成異常導致了多種疾病的發生發展。血管內皮細胞通過增殖、遷移，形成新的血管，并進行血管網絡的重建，從而為器官提供血液和氧氣，是器官生長和發育的重要途徑。該過程由多種生長因子和信號傳導途徑控制，且依賴于促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡調控，當該平衡被打破，則誘發疾病。血管生成不足會引發高血壓、動脈粥樣硬化以及心肌缺血等心血管疾病。血管生成過量，則會誘發腫瘤疾病［4］。ZANG等［5］發現木犀草素能夠通過抑制Notch1表達抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌，進而抑制胃癌細胞的血管生成而形成血管生成擬態。HANG等［6］提出姜黃素能夠抑制胃癌細胞來源的間充質干細胞誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）成管、遷移和集落形成，并與VEGF有關。IWASAKI等［7］使用胎盤生長因子（placental growth factor，PlGF）療法，通過促進心肌修復和血管生成治療缺血性心臟病，取得了良好效果。以上研究結果表明改善血管生成已成為治療血管生成失衡疾病的重要手段。

2 RSA與血管生成

研究發現，血管生成參與了妊娠全過程，妊娠成功取決于胎盤能否構建良好的血管網絡以滿足母體與胎兒之間的生理交換［8］。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量的顯著增加，從而為胎兒提供充足的血液和氧氣，有利于胚胎著床與發育。特別在孕晚期，子宮和臍帶的血流量及血管密度隨著胎兒生長而急劇增加［9］，若血管生成異常，胚胎血供減少，營養供給不足，胚胎無法存活，從而導致流產［10］。王為男等［11］通過免疫組化染色法發現，RSA患者絨毛間質內血管數量明顯減少，管腔狹窄，甚至出現血管破裂和血細胞外溢等現象。Abdel-Razik等［12］采用三維多普勒超聲觀察發現RSA患者子宮動脈血流阻力較高，且子宮內膜血流較低。更有學者以同樣方法證實RSA患者子宮內膜血管化程度較正常妊娠女性降低，并提示螺旋動脈數量不足，顯示患者血管生成與血流灌注受損［13］。以上研究均證明血管生成異常是RSA患者的顯著病理特征，而血管生成的正常進行是成功妊娠的必要前提。因此，改善血管生成成為治療RSA的有效方法之一。

3 血管生成因子和miRNA RSA對胎盤血管生成的影響

3.1 血管生成因子在調控RSA胎盤血管生成中發揮重要作用多個促血管生成因子和抗血管生成因子參與了血管生成過程，如VEGF、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、血管生成素（Angiopoietin， ANG）蛋白家族和金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）等。血管生成因子通過促進或抑制血管生成誘導疾病發生。可見，調控血管生成因子可以成為治療血管生成異常的方式。

3.1.1 VEGF VEGF對血管生成發揮重要的促進作用是參與血管生成過程中的關鍵蛋白［5，14-15］，有研究發現在妊娠過程中胎兒和胎盤組織中均能檢測到VEGF蛋白及其mRNA表達，VEGF通過介導子宮內膜組織血管重塑，利于胚胎著床，是重要的生長調節因子［16］。而通過檢測RSA患者血清發現其VEGF含量較正常妊娠女性顯著降低［17］。XU等［18］通過Meta分析發現，VEGF基因1154G/A（rs1570360）、+936C/T（rs3025039）、634G/C（rs2010963）和583T/C（rs3025020）多態性與RSA易感性有關。

VEGF主要通過調控VEGFR-1和VEGFR-2酪氨酸受體發揮生物學效應。有研究發現，敲除VEGFR-1會導致胎盤血管生成障礙，從而導致流產［9］。sVEGFR-1為VEGF的可溶性受體，又稱為可溶性fms樣酪氨酸激酶（soluble FMS-related tyrosine kinase 1，sFLT-1），它可以與VEGF的膜受體競爭結合VEGF，從而抑制VEGF誘導血管生成的生物學活性，是VEGF的有效拮抗劑［19］。VEGF通過與VEGFR-2結合，促使VEGFR-2發生二聚化和自磷酸化而激活，進而對下游信號通路發揮激活作用，促進血管生成［20-21］。除了在胎盤血管生成中的作用外，VEGF還參與胎盤血流量調節。BOGIC等［22］通過超微結構觀察和熒光染色發現，VEGF存在于羊胎盤的母體和胎兒血管中，且VEGF在妊娠期間可改善膜內血管的分布和通透性。

3.1.2 FGFs FGFs在體內和體外均是有效的血管生成因子。FGF可刺激子宮動脈和胎兒胎盤動脈內皮細胞增殖，促進血管生成，提高多種細胞類型的細胞存活率［23］。唐雪蓮等［24］通過12例人早孕絨毛離體組織及16例RSA絨毛體外分離培養，消化分離出細胞后，加入FGF進行培養，發現FGF能夠促進絨毛滋養層細胞生長。

3.1.3 ANG蛋白家族 ANG蛋白家族也被證明是重要的血管生成因子，對血管生成具有調節作用，包括ANG1、ANG2、ANG3、ANG4和酪氨酸激酶受體1和2（Tie1和Tie2）。ANG蛋白家族均可與Tie結合發揮對血管生成的調節作用，其中ANG1和ANG4能夠通過誘導Tie2的磷酸化促進血管生成，ANG2和ANG3能夠抑制Tie2的磷酸化，從而抑制血管生成［25］。Hess等［26］通過檢測孕鼠模型ANG1含量發現其ANG1 mRNA表達升高。而LEINONEN等［27］發現，ANG1或Tie2的缺失可導致孕鼠血管生成障礙，進而造成不良妊娠結局。楊廷仙［28］通過測定流產患者血清和蛻膜組織ANG1和ANG2發現二者能夠通過影響血管生成造成流產。

3.1.4 EMMPRIN EMMPRIN在胎盤中同樣被證明具有促血管生成作用。DANG等［29］通過比較未孕、孕中期和孕后期的大鼠發現，EMMPRIN有助于上調子宮和血管中基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達，促進胎盤發育早期的螺旋動脈重塑過程。王永清等［30］發現，孕婦絨毛組織中存在EMMPRIN陽性表達，絨毛內滋養層細胞中的EMMPRIN表達隨孕周增加而逐漸加強，通過RNA干擾EMMPRIN的表達能夠抑制滋養細胞侵襲。

3.2 RSA的發生存在miRNA表達差異，并與胎盤血管生成密切相關

3.2.1 RSA的發生存在miRNA表達差異 miRNA是約22個核苷酸的非編碼RNA分子，參與轉錄后的基因調控。有證據表明，miRNA在子宮內膜異位癥、先兆子癇、不育癥和其他生殖系統疾病中起重要作用。DONG等［31］使用人類miRNA芯片分析了RSA患者與正常妊娠婦女的絨毛或蛻膜中miRNA表達譜，發現RSA患者絨毛中hsa-miR-184、hsa-miR-187和hsa-miR-125b-2的表達較高，而hsa-miR-520f、hsa-miR-3175和hsa-miR-4672的表達低于正常妊娠婦女。且在RSA患者蛻膜中發現hsa-miR-517c、hsa-miR-519a-1、hsa-miR-522、hsa-miR-520h和hsa-miR-184表達上調。通過對差異miRNA進行Gene Ontology（GO）分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析發現，RSA的發生與miRNA血管生成有關。以上研究表明RSA的發生存在miRNA表達變化，探尋差異miRNA的表達可以作為診斷RSA的標記物，也可為治療RSA提供可能。

3.2.2 miRNA通過影響胎盤血管生成導致RSA miRNA在RSA的血管生成中發揮了重要作用，ZHU等［32］通過測定RSA患者絨毛和蛻膜組織發現miR-16表達升高，體外實驗中miR-16的上調抑制了HUVECs增殖、遷移和血管形成。進一步通過注射miR-16到小鼠體內，發現異常的miR-16水平會影響微血管密度及胎盤和胚胎重量，并通過抑制VEGF在懷孕小鼠中的表達而引起RSA。XIA等［33］通過分離流產患者胚胎絨毛組織樣本，證明miR-575在流產孕婦的胎盤中被顯著上調。進一步通過體外培養人絨毛膜癌細胞JEG-3，并使用miR-575抑制劑進行干預，發現血管生成蛋白VEGF表達顯著升高，并有效促進了血管生成。以上研究表明miRNA的變化可通過抑制胎盤血管生成進而導致RSA。

4 外泌體參與了胎盤血管生成，在臨床治療RSA中具有應用前景

研究表明，血管生成可以被細胞來源的外泌體調節。外泌體是杯狀磷脂雙層囊泡，大小在40～100 nM之間，外泌體的產生源于細胞膜向內出芽并形成核內體，后期核內體限制膜向多泡體（multivesicular bodies，MVBs）內侵，MVBs與質膜融合釋放出內囊泡，即為外泌體［3］。外泌體已經被證明可以從多種類型細胞中釋放，其包含基于起源組織的蛋白質、mRNA和miRNA，其通過與受體細胞結合進行細胞間的通訊并影響受體細胞功能［3，34］。

研究發現，從RSA患者子宮沖洗液和黏液中能夠分離得到外泌體，表明外泌體存在于子宮內膜上皮細胞的頂端表面上。通過對子宮內膜上皮細胞及其分泌的外泌體進行miRNA分析，發現hsa-miR-200c、hsa-miR-17和hsa-miR-106a含量最高，且與胚胎植入高度相關［35］。GIACOMINI［36］通過分離人胚胎源外泌體發現其能夠被子宮內膜細胞吸收，表明胚胎和子宮內膜能夠通過外泌體進行信息通訊。Komaki則通過培養人足月胎盤組織中的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），并分離培養基中MSCs分泌的外泌體，發現MSCs分泌的外泌體能夠刺激內皮細胞血管生成，表明胎盤中釋放的外泌體具有血管生成的調節作用。

外泌體能夠通過攜帶蛋白和miRNA至靶細胞，進而調節血管生成。VRIJSEN等［37］通過分離心肌細胞祖細胞中的外泌體，發現其對內皮細胞遷移具有促進作用，進一步分離外泌體得到EMMPRIN，發現EMMPRIN能夠通過誘導MMP和VEGF表達促進細胞遷移和血管生成。該實驗為臨床治療RSA提供了新思路。通過分離RSA患者血清及蛻膜組織，并提取其中的外泌體，通過測定外泌體中差異蛋白及miRNA表達，可以快速確定RSA發生的影響因素。甚至通過改造外泌體，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，從而達到治療RSA的目的。

5 中醫治療RSA的現狀

5.1 中醫對RSA病機的認識中醫認為RSA屬“滑胎”“數墮胎”及“屢孕屢墮”等范疇，其最早見于隋代《諸病源候論·婦人妊娠諸侯上》，而宋代齊仲甫在《女科百問》一書中首次提出了其臨床特點為“應期而下”，并指出可以通過預服杜仲丸（由杜仲、續斷組成）預防滑胎，開創了補腎法治療滑胎的先河［38］。通過對醫家治療RSA的總結，普遍認為滑胎主要源于腎虛導致的沖任虛寒，進而引起胎失所養，胎結不實，屢孕屢墮。腎虛失煦或陰虛生熱會導致血瘀，新血下注胞宮不利，胎失所養，進而導致胎動不安或墮胎［39-40］。因此治療RSA的治則可概括為“溫腎補脾，活血化瘀”，從而達到安胎的治療效果。

5.2 中藥復方能夠通過改善血管生成治療RSA滋腎育胎丸是羅元愷教授在“壽胎丸”的基礎上加減而成，可用于治療脾腎兩虛、沖任不固所致的胎動不安及滑胎等，其治療RSA的有效率達90%以上。其功效為補腎健脾、益氣培元、養血安胎、強壯身體。儲繼軍等［41］使用CBA/J×DBA/2小鼠構建RSA動物模型，通過滋腎育胎丸治療，發現其能夠降低RSA小鼠的胚胎丟失率，通過提高RSA小鼠體內VEGF、VEGFR-2表達改善蛻膜血管新生與重鑄。進一步研究發現，滋腎育胎丸能夠改善VEGF/PI3K/AKT信號通路，改善蛻膜組織的微血管密度［42］。

補腎安胎沖劑是安徽中醫藥大學第一附屬醫院的院內制劑，其在“壽胎丸”的基礎上加減，并根據“腎主生殖”“胞胎系于腎”理論形成，可補腎健脾，益氣安胎。研究發現，其治療妊娠成功率達80%以上，經補腎安胎沖劑治療的RSA患者，其血清VEGF水平升高，sFlt-1水平降低，并與促進胎盤絨毛血管形成顯著相關［43］。進一步研究通過DBA/2×CBA/J小鼠構建RSA動物模型，并經過補腎安胎沖劑干預，光鏡及電鏡下觀察到蛻膜組織血管數量與RSA組相比更加豐富，血管壁及血管內皮細胞結構趨于完整［44］。儲繼軍等［32］還發現補腎安胎沖劑能通過升高RSA小鼠蛻膜組織中的VEGF及VEGFR-2表達，從而改善蛻膜組織的血管重鑄［45］。而李偉莉等［46］研究發現補腎安胎沖劑可以通過上調RSA小鼠蛻膜組織中TGF-β1/PI3K/Akt信號通路，進而促進RSA小鼠母胎界面血管生成。郝樂樂［47］研究發現補腎安胎沖劑可通過激活VHL/HIF-1α信號通路從而間接啟動VEGF通路，促進血管生成。

養血安胎方是首都醫科大學附屬北京婦產醫院李恩堂先生的經驗方，目前已在臨床應用30余年，其保胎成功率達98.2%，獲子率為98.0%［48］，可補腎健脾，養血安胎。武穎等［49-50］通過建立腎虛血瘀型復發性流產小鼠模型對該方進行了更深入研究，并使用養血安胎方進行干預，發現該方能夠通過調控TGF-β/Smad通路促進子宮內膜VEGF表達，從而調節胎盤植入，且療效與劑量成正相關。

此外，黨慧敏等［51］研究發現補腎活血方聯合地屈孕酮片能夠明顯上調RSA患者血清中VEGF表達水平，從而促進胎盤血管生成以維持妊娠。馮延紅等［52］通過安胎止血方聯合西藥治療RSA患者，發現患者血清中胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）、Ang-2水平均較治療前升高，從而促進血管生成，提高妊娠成功率。楊秀芳等［53］研究發現補腎益氣養血方聯合西藥治療RSA，有助于升高患者PLGF和Ang-2水平，提高妊娠成功率。

6 總結

越來越多的證據顯示，RSA的發生與血管生成障礙有關，血管生成因子和miRNA作為影響血管生成的關鍵因素，越來越受到研究者的重視。血管生成因子具有促進或抑制血管生成的作用，從而影響疾病的發生發展。通過激動促血管生成因子表達，可以促進血管生成，進而改善RSA。miRNA作為近年的研究熱點，其血管生成調節作用在多種疾病中都得到了驗證，在RSA患者中，miRNA可通過調節血管生成相關因子抑制血管生成，導致RSA的發生。而外泌體作為胎盤與母體間進行交流的通訊形式，能夠通過攜帶蛋白質、mRNA和miRNA至受體細胞，進而影響受體細胞的功能。通過分離RSA患者的血清及蛻膜組織中的外泌體，并測定外泌體中差異蛋白及miRNA的表達，可以快速確定影響RSA發生的蛋白及miRNA。而通過改造外泌體，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，也可作為治療RSA的有效方法之一。

中藥復方治療RSA一般以補腎活血為治則，現代研究發現中藥復方治療RSA多通過調節血管生成因子來促進血管生成，從而改善妊娠成功率。然而，由于復方成分復雜，中藥的治療作用往往是多靶點的，至今尚未發現中藥復方通過調節外泌體，進而調節外泌體中的蛋白及miRNA的相關報道，因此，該領域具有重大研究前景。