抑郁模型大鼠不同腦區5-HT1A蛋白表達及加味溫膽湯的干預作用*

張 齊，楊 瑞，韋利軍，韋海英，高 月，武 麗

廣西中醫藥大學廣西中醫基礎研究重點實驗室，廣西 南寧 530200

隨著現代社會科技的進步，經濟的快速發展，高效率快節奏的工作、生活方式，致使人們的心理負荷不斷加重，由心理、社會環境等因素導致的精神、心理和心身疾病的發病率日漸增高，在我國疾病流行譜中的地位顯著上升，尤其抑郁癥已經成為當今社會的多發病、常見病，是全球面臨的重大公共衛生問題［1-3］。在最新中國精神疾病流行研究中發現抑郁癥已成為精神障礙患病率排名第二位的疾病，終生患病率高達7.4%。抑郁癥患者的發病機制與“邊緣系統-皮層-紋狀體-蒼白球-丘腦”神經環路關系密切，神經影像學研究發現額葉、扣帶回、海馬、基底節等腦區的結構及功能連接改變可導致抑郁癥的發生［4-6］。

抑郁癥屬中醫“郁證”范疇，是由情志不舒，氣機郁滯引起的一類病證。主要表現為心情抑郁、情緒不寧、脅肋脹痛，或易怒善哭，以及咽中如有異物梗阻、失眠等各種復雜癥狀［7-8］。情志致郁理論在明代已經形成，而且隨著現代社會競爭的加劇，生活壓力增大而日益受到重視。現代醫學結合社會文化、心理、遺傳等各因素，強調了失敗的生活事件引起的情志不舒在抑郁癥發病中的重要促發作用。升降平調為旨的中藥復方溫膽湯出自姚僧垣《集驗方》，全方寒溫平調、升降并用，即可理氣解郁，又可降逆化痰，臨床實踐證實對情志具有雙向調節作用，但機制尚未闡明。因此，本課題在前期研究工作的基礎上，以抑郁模型大鼠海馬、下丘腦、前額皮質、杏仁核不同腦區5-HT1A受體蛋白表達變化為切入點，比較抑郁模型大鼠不同腦區5-HT1A受體蛋白表達差異，探討加味溫膽湯“升降平調”抗抑郁作用的神經生化機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組選用SPF級雄性SD大鼠，體質量180～200 g（購自湖南斯萊克達實驗動物有限公司），動物合格證號：SYXK（桂）2019-0001。大鼠造模前進行曠場實驗，將行為學評分相近的32只大鼠隨機分為抑郁模型組、抑郁中藥組、抑郁西藥組、正常對照組各8只。

1.2 藥物制備百憂解（禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字520160029，規格：20 mg/片）。加味溫膽湯藥物組成：枳實2枚，竹茹6 g，半夏6 g，橘皮9 g，生姜12 g，甘草3 g，石菖蒲9 g，合歡花12 g。經中藥植化室鑒定后按照標準操作規程煎煮，煎煮液濃縮成浸膏，4 ℃冰箱內保存備用。

1.3 儀器與試劑蛋白核酸凝膠電泳轉印系統（BIO-RAD，Mini Protean Tetra Cell Mini Transblot cell）；電泳儀（BIO-RAD，PowerPac Universal）；凝膠成像分析系統（BIO-RAD，ChemiDoc）；小動物行為記錄分析系統（上海軟隆，Anymaze）；臺式高速冷凍離心機（Thermo Fisher，ST16R）；5×蛋白上樣緩沖液（Solarbio，P1040）；ECL超敏發光液（Solarbio，PE0010）；十二烷基磺酸鈉（Solarbio，S8010）；30%丙烯酰胺甘氨酸（Solarbio，A1011）；5HT1A Receptor兔多克隆抗體（Abcam，ab85615）；辣根酶標記山羊抗兔lgG（Abcam，ab205718）。

1.4 方法

1.4.1 模型制備與評價

1.4.1.1 慢性輕度不可預見性 應激抑郁動物模型［9］自分組之日起，抑郁模型組及抑郁中、西藥組接受21天各種未預知的應激，包括通宵照明，24 h禁食，24 h禁水，45 ℃烘箱熱烘5 min，4 ℃冷水游泳5 min，夾尾l min，高速水平振蕩3 min，懸尾l min，100伏電擊足底l min等9種刺激，21天內隨機安排每日給予1種刺激，同一種刺激不能連續出現，每種刺激出現2～3次，使動物不能預知刺激方式。

1.4.1.2 動物模型行為學評價［10］曠場實驗（Open-field法）是比較常用而客觀的動物模型行為學研究方法。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內，以動物穿越底面的格數為水平運動次數，反映動物的活動度；以后肢直立次數（兩前爪騰空或攀附箱壁）為垂直運動次數，反映動物對新鮮環境的好奇程度。記錄水平運動次數及垂直運動次數，每只大鼠測定1次，每次3 min，用清水和75%酒精依次徹底清潔敞箱后，再進行下一只大鼠的觀察。

1.4.2 藥物干預方法 造模后開始給藥，給藥時間為35天，抑郁中藥組胃飼加味溫膽湯藥液12 g/kg；抑郁西藥組胃飼百憂解1.8 mg/kg，以上各組藥物用0.5%羧甲基纖維素溶液配制，各組均給相同體積的受試藥物0.1 mL/10 g，每日1次。抑郁模型組和正常對照組胃飼等容量生理鹽水，所有動物自由進食和飲水，每日8：00開始給藥，干預過程中抑郁中藥組大鼠死亡2只。

1.4.3 取材方法 末次給藥結束，行為學檢測之后，10%水合氯醛（0.3～0.4 mL/100 g體質量）腹腔麻醉各組大鼠，迅速斷頭、冰上取腦，冰上分離前額皮質、海馬CA3區、下丘腦及杏仁核，剪碎，加入預冷1.5 mL裂解緩沖液，冰上勻漿，冰上孵育30 min，將勻漿液轉移至1.5 mL的EP管，4 ℃離心半徑16 cm，10000 r/min離心10 min，取上清，再離心10 min，取上清，-20 ℃保存備用。

1.4.4 5-HT1A蛋白Western blot檢測方法［11］提取前額皮質、杏仁核、下丘腦及海馬CA3區組織中總蛋白，BCA蛋白定量法測定各腦區蛋白濃度，根據蛋白濃度，以40 μg/孔的蛋白量上樣電泳，各腦區蛋白經轉膜封閉后4 ℃分別與一抗5-HT1A（1∶1500）、β-actin（1∶1500）蛋白搖床過夜；次日分別與辣根酶標記山羊抗兔lgG（1∶2000）結合反應，ECL發光顯色后于凝膠成像分析系統中曝光測定條帶灰度值，采用Image J軟件對圖像進行光密度值分析，以β-actin作內參蛋白，分析目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值比值。

1.5 統計學方法采用SPSS 26.0軟件分析數據，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊時采用Kruskal-Wallis H檢測，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學抑郁模型大鼠水平運動次數、垂直運動次數及總路程較正常對照組減少（P＜0.05），加味溫膽湯能改善抑郁模型大鼠行為表現（P＜0.05），百憂解只對總路程有影響（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠行為學比較（±s）

表1 各組大鼠行為學比較（±s）

注：a表示與正常對照組比較，P＜0.01；b表示與抑郁模型組比較，P＜0.01

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2.2 大鼠不同腦區5-HT1A蛋白表達抑郁模型組大鼠海馬CA3區5-HT1A蛋白表達升高，加味溫膽湯能降低CA3區5-HT1A蛋白表達（P＜0.05），百憂解能提高杏仁核5-HT1A蛋白表達（P＜0.05）。見表2及圖1。

表2 各組大鼠不同腦區5-HT1A蛋白相對表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠不同腦區5-HT1A蛋白相對表達水平比較（±s）

注：a表示與正常對照組比較，P＜0.01；b表示與抑郁模型組比較，P＜0.01

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圖1 不同腦區5-H1A蛋白相對表達情況

3 討論

無論是新型抗抑郁藥物還是傳統抗抑郁藥物，在治療抑郁癥過程中都會出現諸多不良反應。三環類抗抑郁藥（tricyclic antidepressant，TCA）為第一代單胺再攝取抑制劑，臨床用藥包括阿米替林、丙咪嗪以及多慮平，不良反應主要源于抗膽堿作用，可能造成患者便秘、尿潴留及視力模糊等情況，更有甚者會造成患者體位性低血壓、心律失常以及心肌梗死等［12-15］。選擇性5-HT再攝取制劑副作用小，患者依從性較好，但有一定耐受性，也有常見的不良反應，包括惡心、頭痛、腹瀉、激越、失眠、嗜睡、眩暈、顫抖、性功能障礙［16-18］。另外，帕羅西汀有體位性低血壓，氟西汀可致再生障礙性貧血等副反應［19-25］。中醫藥因擅長身心整體論治而在疾病的防治中具有一定優勢，中藥復方以多成分、多環節、多層次、多靶點的藥理學作用見長［2，21-26］。因此，從天然藥物和中藥復方中尋找、研制療效好、副作用小、適合長期服用的抗抑郁藥日益受到重視。

本研究在中醫情志理論指導下，在前期工作基礎上，認為寒溫平調、升降并用的中藥復方加味溫膽湯可能通過調節情緒神經回路不同腦區的5-HT1A蛋白變化發揮抗抑郁情志調節作用。本研究結果表明，抑郁模型大鼠不同腦區5-HT1A蛋白表達不一致，抑郁模型大鼠主要表現為海馬CA3區5-HT1A蛋白表達升高，而加味溫膽湯可能通過降低抑郁模型大鼠海馬CA3區5-HT1A蛋白表達，從而實現抗抑郁、情志調節作用，但詳細機制有待進一步闡明。