云南省無量山烏骨雞傳染性支氣管炎和大腸桿菌混合感染的診斷

耿志誠，宋春蓮，張 瑩，羅 高，李鑫漢，羅班乾，李 鮮，舒相華*

（ 1.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201 ； 2.昆明偉牧得生物科技有限責任公司，云南 昆明 650201 ； 3.云南省永德縣畜牧獸醫局，云南 臨滄 677600 ； 4.云南省昭通市畜牧局，云南 昭通 657000 ）

雞傳染性支氣管炎（infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一類急性、高接觸性、傳染性呼吸系統疾病[1]，是肉雞、蛋雞養殖過程中常見的一種傳染病。IB的易感動物為各日齡的雞，病程持續較短，一般2 d內即出現癥狀，癥狀為咳嗽、打噴嚏、氣喘、呼吸道啰音、流淚流涕、精神沉郁、昏睡等[2]。IB具有潛伏期短、發病急、傳播途徑廣、傳播迅速的特點，易出現大規模感染，且變異性強，變異毒株多，對疫病防控凈化造成了很大挑戰[2-4]。大腸桿菌病是由腸桿菌科致病性大腸埃希菌引起的局部性或全身性感染。大腸桿菌是一類機會致病菌，當飼養條件差或宿主免疫力低下時會引起發病，主要引起宿主腸炎，嚴重時可導致敗血癥、心包炎、卵黃性腹膜炎或死亡等，嚴重危害雞場經濟效益[5]。大腸桿菌既可單一發病，也可繼發感染其他病毒性疾病，如新城疫、禽流感、IB等[6]。

近年來，雞場疾病發病情況趨于多重病原混合感染的趨勢?；旌细腥静粌H加快了發病進程，也會導致一些特征癥狀不明顯，對雞場經濟效益造成更大損失，加大了診斷和防治的難度[7]。無量山烏骨雞屬于云南省六大名雞之一，一雞場內烏骨雞出現精神高度沉郁、呼吸困難、腹瀉等癥狀，本研究采用臨床觀察及病理解剖、分子生物學檢測技術、細菌分離培養、生化鑒定、藥敏試驗和病理組織切片進行診斷，為大腸桿菌和IBV混合感染的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云南省大理市某雞場有無量山烏骨雞3 000羽，未接種IB疫苗。發病后傳染迅速波及全群，病死率20%。選取發病癥狀明顯的病雞2只無菌剖解及采集病變內臟組織。

1.2 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、WD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）、冷凍高速離心機（Thermo Scientific）、303-S電熱恒溫培養箱（滬南試驗儀器廠）、DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、TKY-BMB型石蠟包埋機（湖北泰康醫療設備有限公司）、病理組織切片機（REICHERT HISTOSTAT）。

1.3 主要試劑

組織RNA提取試劑盒（TaKaRa）、反轉錄試劑盒（TaKaRa）、LB營養瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）、麥康凱瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）、巧克力血瓊脂培養基基礎（北京索萊寶科技有限公司）、SS瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）、生化鑒定試劑盒（廣州環凱微生物生物科技有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 臨床診斷及病理解剖

觀察病雞整體情況，并對其精神狀況、天然孔、體表被毛進行全面系統的檢查；結合對畜主詢問發病雞總體生理情況、免疫情況和健康水平，進行初步評估和記錄。

按照顧城均[8]的方法進行病理解剖，并做好解剖記錄。取臨床癥狀明顯的2只發病雞進行病理剖解，并對剖解病變部位進行無菌采樣，以進行下一步檢測。

1.4.2 分子生物學檢測

取雞病變明顯組織液氮研磨后，加入1 mL PBS，按照核酸提取試劑盒說明書按照步驟提取核酸。

反應體系：DNA/cDNA模板2 μL、上下游引物各0.5 μL、Ex Taq Premix 12.5 μL，加去離子水補足至25 μL。

擴增程序為：97 ℃預變性5 min，97 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環35次；72 ℃擴增10 min。退火溫度見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

取7 μL PCR產物1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像分析儀上查看結果。

1.4.3 細菌分離培養

無菌采取病變部位，采用接種環蘸取病料后分別接種于高壓滅菌的LB培養基、麥康凱培養基、血平板和SS培養基上。置于37 ℃恒溫箱內培養12 h，對培養皿內生長的單菌落挑菌落進行純培養，純培養12 h后對培養基內細菌進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4.4 生化鑒定試驗挑取純培養后的菌落，按照生化鑒定試劑盒說明書進行生化鑒定試驗。

1.4.5 藥敏試驗

從培養皿中挑選細菌菌落加入裝有LB肉湯的離心管中，放入37 ℃恒溫振蕩器中振蕩培養24 h，在LB培養基上均勻涂開，根據革蘭氏染色及生化試驗結果選定菌種敏感的抗生素貼上藥敏片，37 ℃恒溫箱中培養24 h后，測量抑菌圈直徑。

結果判定標準：按照WS/T 125—1999腸桿菌科藥敏試驗直徑解釋標準進行判定，其中S表示敏感，I表示中介，R表示耐藥。

1.4.6 病理組織切片觀察

取病變明顯的組織用甲醛∶蒸餾水1∶9稀釋后浸泡固定，24 h后換液。將固定好的組織取出后切成薄片，按照石蠟切片及HE染色步驟進行切片染色，鏡檢切片觀察病變明顯的組織。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀及病理剖解結果（見圖1）

由圖1（a）可知，發病雞精神高度沉郁、呼吸困難、呼吸有啰音，肛周被羽凌亂且沾有糞便，腹瀉有黃棕色稀便。

由圖1（b）、圖1（c）可知，剖解可見發病雞鼻腔、氣管、支氣管內有漿液性分泌物；由圖1（d）可知，肺臟有出血淤血現象、有肺實質變性呈蝦肉樣變；由圖1（e）、圖1（f）可知，腸道鼓氣、腸壁變薄，切開有黃色泡沫狀內容物，盲腸扁桃體有炎性腫大。

2.2 分子生物學診斷結果

根據病雞臨床癥狀及解剖情況，診斷為呼吸系統疾病，相關PCR檢測結果見圖2。

由圖2可知，1號雞、2號雞在249 bp處均有明亮條帶，且無雜帶，其余3種疾病均無條帶，故診斷為IB陽性。

圖2 分子生物學診斷結果Fig.2 Molecular biological diagnosis results

2.3 細菌分離培養結果及生化鑒定試驗結果

2.3.1 革蘭氏染色鏡檢結果（見圖3）由圖3可知，麥康凱培養基和SS培養基上長出粉紅色菌落，挑取單菌落純培養經革蘭氏染色，鏡檢可見革蘭氏陰性短桿狀細菌單個存在。

圖3 革蘭氏染色鏡檢結果Fig.3 Microscopic examination results of Gram staining

2.3.2 生化鑒定試驗結果

經生化鑒定試驗可知，該菌株發酵葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖蔗糖和木糖試驗陽性，明膠試驗、VP試驗和硫化氫試驗陰性，結果符合大腸桿菌的生化特性。根據革蘭氏染色和生化鑒定結果，判定此菌為大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗結果（見表2）

由表2可知，該大腸桿菌對頭孢喹肟、阿莫西林、磺胺甲惡唑、四環素、多西環素和頭孢曲松鈉等6種抗生素顯示耐藥，對新霉素顯示敏感。

表2 藥敏試驗結果Tab.2 Results of drug sensitivity test

2.5 病理組織切片觀察結果（見圖4）

由圖4可知，通過鏡檢病理組織切片可見，發病雞肺部病變明顯，肺泡內血液滲出及炎性滲出物浸潤。

圖4 病理組織切片觀察結果Fig.4 Observation results of pathological tissue section

2.6 治療

根據PCR檢測結果以及藥敏試驗結果，在雞群日糧中添加抗病毒復方中藥及新霉素；推薦使用扶正解毒散（方劑組成為板藍根300 g、黃芩60 g、淫羊藿30 g），打粉過篩后添加于日糧中，也可煎煮后添加于飲水中，每天兩次，連續飼喂一周。

此外，日糧和飲水中添加復合維生素B及維生素C以增強雞群對病原的抵抗力。發病后對雞群進行緊急免疫接種，雛雞采用雙倍劑量滴鼻點眼，成雞通過飲水的方式緊急接種產生IB抗體，癥狀嚴重的雞酌情加倍劑量，沒有治療價值的發病雞應及時淘汰并無害化處理。

3 討論

我國家禽規?；B殖迅猛發展，家禽養殖的產業化水平較高，但集約化程度卻與飼養管理技術成反比。規?；B殖的高飼養密度帶來較高經濟效益的同時，也加速了疾病在群體中的傳播速度。我國肉雞養殖面臨的主要問題是病原微生物的復雜化和臨床癥狀非典型化，混合感染是威脅肉雞養殖的重大問題[9-11]。

有報道指出，感染IBV的禽類呼吸道黏膜會出現纖毛脫落、停止擺動，黏膜上皮對大腸桿菌等病原的抵抗力降低，導致混合感染[7,12]。而大腸桿菌感染后會導致腹瀉、食欲不振等癥狀，混合感染后加重病情、增加病死率。有研究報道，2020年6月廣西某火雞場內火雞出現了腫頭、流淚、精神沉郁等癥狀，并出現死亡，經過鑒別診斷確定為IBV混合感染大腸桿菌[13]。廣西某雞場對出現呼吸道癥狀及腹瀉的發病雞進行隔離，但仍出現更多發病雞，求助當地獸醫部門后確診為IBV及大腸桿菌病混合感染[14]。本研究中，發病雞診斷為IBV混合感染大腸桿菌，加重雞群發病情況并導致雞群病死率增高，產生耐藥性的大腸桿菌也阻礙了雞場對本輪疫病的防控。

目前尚無針對IB的特效藥，故應注重預防，防大于治[15]。雞群發病后應及時隔離病雞，并對雞舍進行徹底消毒。保持良好的飼養管理環境，保持雞舍勤清理消毒及良好通風，禽舍內集群密度控制在合理范圍內，保持雞舍周圍安靜、減少雞群應激是防止雞群免疫力低下的必要基礎[11]。發生大腸桿菌與IBV混合感染時，應對雞場中的糞便及無治療價值的發病雞進行無害化處理，對雞群進行嚴格檢疫、隔離制度[16]，并緊急接種IB疫苗，應根據細菌分離培養及藥敏試驗的結果有針對性地選用抗菌藥物治療大腸桿菌病[17-18]。后續飼養應在雞飼料中添加復方中藥制劑起到抗炎抗病毒、提高雞群對病原微生物的抵抗能力。本試驗中，結合藥敏試驗結果選擇抗菌藥、抗病毒藥物進行治療后，該雞場內疫情得到了有效控制。

4 結論

本研究結果表明，該雞群發病的原因為IB與大腸桿菌混合感染，且大腸桿菌已產生一定的耐藥性。