牛流行熱檢測(cè)方法及疫苗研究現(xiàn)狀

石亞楠，李小龍，鮑顯偉，王雪妍，許立華

（ 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021 ）

牛流行熱（bovine ephemeral fever，BEF）又稱三日熱、暫時(shí)熱，是一種由節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒性疾病[1-2]。BEF的主要癥狀表現(xiàn)為突發(fā)高熱（41~42 ℃）、食欲不振、關(guān)節(jié)腫脹、跛行。該病的特點(diǎn)是發(fā)病快，病程僅持續(xù)1~3 d，恢復(fù)迅速。1867年，BEF首次在南非被報(bào)道，隨后傳入中東、澳大利亞、日本、中國(guó)等國(guó)家及地區(qū)[3]。BEF病死率低，發(fā)病率高，主要導(dǎo)致泌乳牛產(chǎn)奶量突然下降、肉牛狀況不良、役用牛癱瘓，造成養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失慘重。近年來，BEF的發(fā)病率和病死率不斷升高。2002年，河南省BEF流行病學(xué)報(bào)告病死率達(dá)到17%~18%；2012年，土耳其一牧場(chǎng)BEF病死率高達(dá)20%；2015年，西藏和甘肅天祝地區(qū)牦牛BEFV抗體陽性率為23.8%~45.09%[4-7]。因此，檢測(cè)和防控BEF已成為畜牧業(yè)的首要任務(wù)。

牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）屬于彈狀病毒科暫時(shí)熱病毒屬，由負(fù)義單鏈RNA基因組組成。BEFV共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，包括核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）、RNA依賴RNA聚合酶大蛋白（L）[8]。G蛋白是一類跨膜糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒細(xì)胞黏附、進(jìn)入和致病性，表面有4個(gè)抗原中和位點(diǎn)（G1~G4），能夠誘導(dǎo)抗體分泌和保護(hù)性體液免疫[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，G1位點(diǎn)僅與BEFV的血清發(fā)生反應(yīng)，而G2、G3、G4抗原位點(diǎn)與同科其他病毒會(huì)產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)[11]。G蛋白作為中和抗體的靶標(biāo)，廣泛應(yīng)用于BEFV檢測(cè)方法建立和新型BEF疫苗開發(fā)。本文對(duì)BEF的檢測(cè)方法以及疫苗開發(fā)的研究近況進(jìn)行梳理總結(jié)，以期為BEF的防控提供一定參考。

1 BEF檢測(cè)方法的研究近況

1.1 病原學(xué)檢測(cè)方法

臨床上常將采集的患病?？鼓准?xì)胞接種于1~3日齡的乳鼠腦中，經(jīng)鼠腦傳代分離得到病毒后，進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)鑒定；或?qū)⒇?fù)染分離的白細(xì)胞置于電鏡下，觀察病毒顆粒的形態(tài)。BEFV可在牛腎細(xì)胞（MDBK）、倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、白紋伊蚊細(xì)胞（C6/36）等細(xì)胞系中分離培養(yǎng)。Karayel-Hacioglu等[12]將疑似感染BEFV的牛血樣品中的白細(xì)胞層接種于Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中，盲傳2代，感染后48 h內(nèi)觀察到特異性細(xì)胞病變反應(yīng)（CPE），后續(xù)的傳代中接種后24 h內(nèi)即可觀察到CPE，最終經(jīng)過RT-PCR確認(rèn)分離株是BEFV。病毒分離鑒定是最傳統(tǒng)也是最準(zhǔn)確的診斷方法，但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求過高，且操作復(fù)雜，不適用于BEFV快速診斷，無法在基層養(yǎng)殖場(chǎng)推廣應(yīng)用。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.2.1 微量血清中和試驗(yàn)

微量血清中和試驗(yàn)（neutralization test）是檢測(cè)病毒常用的方法。1988年，白文彬等[13]應(yīng)用BEF北京毒株制備了微量血清中和試驗(yàn)抗原和高免血清，進(jìn)行特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明，BEF微量中和試驗(yàn)特異性強(qiáng)、敏感性高，與常量中和試驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果一致。BEF微量中和試驗(yàn)是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部首次推薦檢測(cè)BEFV的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法操作煩瑣，結(jié)果誤差較大，難以應(yīng)用于臨床大批量血清樣品檢測(cè)。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）是血清學(xué)檢測(cè)最常用的檢測(cè)方法，靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確、適用范圍廣。目前以體外表達(dá)重組BEFV G蛋白建立了幾種ELISA方法。黃德萱[2]以BEFV G 蛋白制備的兔源多克隆抗體作為捕獲抗體，以G1表位單克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了BEFV抗原捕獲ELISA。采用該方法對(duì)彈狀病毒科其他病毒以及牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該方法特異性較好，可為BEFV臨床樣品的篩查提供技術(shù)支持。但該方法制備抗體成本較高，且BEFV感染病程較短時(shí)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。汪祥斌[14]基于原核表達(dá)的重組蛋白BEFV G1，建立了檢測(cè)BEFV抗體的間接ELISA方法，利用該方法驗(yàn)證微量中和試驗(yàn)檢驗(yàn)的牛血清，結(jié)果顯示，臨界值為0.347，敏感性為96%，特異性為92%，表明該方法具有較好的敏感性和特異性，為BEF的防控提供一定幫助。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

1.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測(cè)速度快、敏感性和特異性高，尤其適用于鑒定體外分離不到病原的情況。國(guó)內(nèi)外研究人員針對(duì)BEF開發(fā)了一系列高靈敏度和特異性的PCR方法，如反轉(zhuǎn)錄PCR、一步式反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。由于RNA病毒易降解，為簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，避免操作過程中的污染，廖承球等[15]建立了BEFV一步法RT-PCR，并使用該方法對(duì)采集的17份疑似BEF患牛全血進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致。該方法中反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增均在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，與常規(guī)PCR相比，不僅可縮短檢測(cè)時(shí)間，還可節(jié)約試劑、降低污染。

近年來，在RT-PCR的基礎(chǔ)上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）的應(yīng)用更加廣泛。因RT-qPCR具有交叉污染率低、反應(yīng)時(shí)間短和檢測(cè)結(jié)果精確等特點(diǎn)，多應(yīng)用于獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室。汪祥斌等[11]基于BEFV G蛋白的保守序列設(shè)計(jì)探針和引物，建立了BEFV TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為1×101copies/μL，與牛藍(lán)舌病毒、牛赤羽病毒無交叉反應(yīng)，表明該方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可節(jié)省病毒核酸用量。Gao等[16]基于SYBR green Ⅰ技術(shù)開發(fā)了一種低成本的RT-qPCR檢測(cè)方法，并對(duì)BEFV G設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，能夠檢測(cè)廣譜BEFV毒株，其靈敏度與TaqMan RT-PCR檢測(cè)不分高下，比常規(guī)PCR高百倍，而且可應(yīng)用于定量分析牛體內(nèi)病毒動(dòng)力學(xué)。

LUXTM熒光RT-PCR是一種擴(kuò)增體系簡(jiǎn)單，成本比TaqMan探針技術(shù)低，特異性比核酸染料技術(shù)強(qiáng)，但敏感性和特異性與TaqMan探針技術(shù)不相上下的實(shí)時(shí)核酸擴(kuò)增技術(shù)[17]。劉志玲等[18]在BEFV G基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了特異LUXTM熒光RT-PCR引物，首次建立了特異性BEFV LUXTM熒光RT-PCR快速檢測(cè)方法，其敏感性比傳統(tǒng)RTPCR方法高100倍，對(duì)臨床BEF的檢測(cè)具有應(yīng)用價(jià)值。雖然RT-qPCR具有高通量擴(kuò)增的能力，但熱循環(huán)儀價(jià)格昂貴并且需要專業(yè)的技術(shù)人員，導(dǎo)致該方法在應(yīng)用上存在局限性，難以在基層推廣使用。

1.3.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增方法。RT-LAMP擴(kuò)增的各個(gè)步驟均在同一溫度進(jìn)行，不需特定的儀器設(shè)備，其靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)優(yōu)于PCR技術(shù)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于RT-PCR。賈坤等[19]建立了一種高效、簡(jiǎn)便、可視化的RT-LAMP檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)PCR相比，RT-LAMP的檢測(cè)靈敏度提高至10倍以上。由于RT-LAMP反應(yīng)本身特異性強(qiáng)、靈敏性高，所以對(duì)于操作環(huán)境要求嚴(yán)格，稍有不慎便可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）被認(rèn)為是可取代PCR實(shí)現(xiàn)便攜式快速核酸檢測(cè)的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，但準(zhǔn)確檢測(cè)RPA產(chǎn)物還需進(jìn)一步優(yōu)化。側(cè)流層析試紙條檢測(cè)法（recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick，RPALFD）可對(duì)RPA產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測(cè)，與其他檢測(cè)方法相比，該方法用時(shí)短，5~10 min內(nèi)即出可視化檢測(cè)結(jié)果，適用于基層養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)。Hou等[20]以BEFV G基因?yàn)槟繕?biāo)對(duì)象設(shè)計(jì)RPA引物和LF探針，建立應(yīng)用于檢測(cè)BEFV的可視化RPA-LFD檢測(cè)技術(shù)，通過肉眼直觀判斷橫向流動(dòng)試紙條上的擴(kuò)增產(chǎn)物；結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物在38 ℃下進(jìn)行20 min即可被檢測(cè)到，其臨床檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR相比，符合率高達(dá)96.09%（123/128），高于常規(guī)PCR的符合率。RPA比其他BEFV核酸檢測(cè)方法快，不需要昂貴且復(fù)雜的熱循環(huán)儀，非常適合BEFV核酸現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1.4 其他檢測(cè)方法

國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在開發(fā)和應(yīng)用傳感器技術(shù)，利用動(dòng)物身上的傳感器檢測(cè)皮毛、體溫和行為指標(biāo)實(shí)現(xiàn)特定傷害或疾病的自動(dòng)診斷[21]。Tobin等[22]利用牛身上加速度傳感器遠(yuǎn)程監(jiān)測(cè)BEF相關(guān)行為變化，通過分析加速度計(jì)讀數(shù)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用加速度計(jì)讀數(shù)具有診斷BEF和其他疾病的潛力，有望成為新的有力檢測(cè)工具。

2 BEF疫苗的研究近況

疫苗接種是預(yù)防和控制BEF最有效的措施。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)研究出多種候選疫苗應(yīng)用于預(yù)防BEF感染，并在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)不同疫苗的保護(hù)效果不同。

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是將病原體在細(xì)胞基質(zhì)上進(jìn)行培養(yǎng)，通過加熱或用化學(xué)劑（福爾馬林、甲醛、β-丙內(nèi)酯、結(jié)晶紫等）使病原體失去致病力而保留抗原性的一類疫苗。BEFV只有一個(gè)血清型，但已分離了多種變異BEFV毒株，一些分離株滅活后，免疫牛表現(xiàn)出良好的免疫原性和保護(hù)效力。國(guó)內(nèi)市售的BEFV滅活疫苗使用的是1976年在中國(guó)分離的JB76H毒株。朱雁等[23]對(duì)淮海經(jīng)濟(jì)區(qū)多個(gè)縣市養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了BEF流行病學(xué)調(diào)查分析及BEFV疫苗免疫效果評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2011年之前未免疫BEF滅活疫苗的縣市出現(xiàn)了暴發(fā)式流行；2011—2017年免疫BEF滅活疫苗的縣市只出現(xiàn)了零星病例；而其他未免疫BEF滅活疫苗的縣市均多次發(fā)生BEF，連續(xù)兩次免疫BEF滅活疫苗后，免疫中和抗體合格率達(dá)到了80%，表明BEF滅活疫苗具有良好的保護(hù)作用。近年來，也有研究報(bào)道了接種BEFV滅活疫苗的牛群出現(xiàn)疫苗接種失敗[24]的案例。研究人員使用不同佐劑的滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，從而提高BEF滅活疫苗的保護(hù)效力。Aziz-Boaron等[25]基于以色列當(dāng)?shù)囟局觊_發(fā)了水包油滅活疫苗，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，接種3次或4次疫苗后，中和抗體滴度保持穩(wěn)定（1∶256），但4個(gè)月后檢測(cè)到中和抗體滴度有所下降。Yang等[26]通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)缺失重組弧菌鞭毛蛋白制備的滅活赤羽病毒（AKAV）＋BEFV疫苗，結(jié)果顯示，在小鼠和豚鼠試驗(yàn)中，滅活A(yù)KAV+BEFV疫苗對(duì)AKAV和BEFV的VNA滴度略高于活BEFV疫苗；在豬和牛中抗AKAV和BEFV可誘導(dǎo)高VNA滴度（1∶64~1∶512），表明AKAV+BEFV滅活疫苗具有高免疫原性和良好的安全性，但仍需進(jìn)一步開展田間試驗(yàn)，研究疫苗的免疫效力和持久性。

2.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過傳統(tǒng)方式減弱病原體的毒性或敲除病原體的毒力基因，但保留了病原體在宿主體內(nèi)增殖的一類疫苗。已有商品化減毒活疫苗在BEF流行的國(guó)家使用，如澳大利亞、日本、南非。南非通過每年給易感牛皮下接種由Onderstepoort Biological Products（OBP）生產(chǎn)的減毒B-Phemeral疫苗控制BEF疫情[27]。BEF減毒活疫苗免疫力持久，但存在安全隱患，可能出現(xiàn)毒力返強(qiáng)、RNA病毒易突變等情況。

2.3 基因工程疫苗

與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗相比，基于BEFV抗原基因進(jìn)行開發(fā)的基因工程疫苗更安全且成本更低。因此，開發(fā)高效、安全、平價(jià)的基因工程疫苗是目前BEF疫苗研發(fā)的重要方向。

2.3.1 亞單位疫苗

BEF亞單位疫苗是通過微生物或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BEFV的保護(hù)性抗原，經(jīng)分離純化后加入佐劑制備而成。此類疫苗無感染性成分，不需要滅活，也不具有致病性，安全性高，但保護(hù)效力有待提高。目前，市面上的疫苗僅限于局部毒株，保護(hù)有限，而抗原表位的預(yù)測(cè)鑒定有助于設(shè)計(jì)BEFV表位疫苗。Pyasi等[28]基于BEFV結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、M、G），利用綜合免疫信息學(xué)方法設(shè)計(jì)了第一個(gè)針對(duì)BEFV的多表位亞單位疫苗，該模型理論上具有刺激細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的特征，有助于開發(fā)BEFV的潛在疫苗。Mollazadeh等[29]從不易突變和基因組多樣性的BEFV G蛋白序列區(qū)域設(shè)計(jì)出具有高免疫原性的多表位，可作為設(shè)計(jì)所有BEFV毒株的候選疫苗。

2.3.2 病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將BEFV抗原基因重組至病毒載體內(nèi)，激發(fā)高水平的細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。目前已被報(bào)道的有以狂犬病病毒、新城疫病毒、牛痘病毒和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒為載體表達(dá)BEFV G蛋白的活載體疫苗。Zheng等[30]以改良的SAD B19疫苗株（LBNSE）為載體表達(dá)BEFV-G的重組狂犬病病毒LBNSE-BG，結(jié)果顯示，單劑量LBNSE-BG免疫小鼠，8周后體內(nèi)誘導(dǎo)出1∶63.3滴度的BEFV中和抗體。Zhang等[31]利用重組新城疫病毒系統(tǒng)表達(dá)BEFV的糖蛋白，結(jié)果顯示，rL-BEFV-G在牛中誘導(dǎo)中和抗體滴度為1∶128。上述研究結(jié)果表明，病毒活載體疫苗可以作為開發(fā)針對(duì)BEFV感染的疫苗一種選擇。

2.3.3 核酸疫苗

BEF核酸疫苗是將編碼BEFV G蛋白的外源基因直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答[32]。疫苗接種后，僅針對(duì)疫苗靶向的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。核酸疫苗因具有不存在毒力反強(qiáng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，免疫應(yīng)答持久，易生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)得到了更為廣泛的關(guān)注。

Pasandideh等[9]成功表達(dá)了pcDNA3.1-G1構(gòu)建體并在小鼠免疫中證實(shí)該表達(dá)質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)抗BEFV中和抗體。Abayli等[33]以pcDNA4-G質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，結(jié)果顯示，動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生了一定的免疫反應(yīng)，但pcDNA4-G免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)比BEFV免疫小鼠低且晚，這可能與疫苗接種途徑、免疫耐受性有關(guān)。綜上，未來研制BEF核酸疫苗需優(yōu)化表達(dá)載體，有效結(jié)合體液免疫和細(xì)胞免疫，尋找更好的免疫途徑，提高疫苗的保護(hù)率。

3 結(jié)論

BEF是一種因病程短、癥狀輕而在疫情防控中常被忽視的疾病。隨著國(guó)際牲畜貿(mào)易愈加頻繁，極大增加了BEF的傳播風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)有關(guān)研究報(bào)告顯示，近年來BEF的病死率顯著增高，因而應(yīng)對(duì)BEF的防控應(yīng)引起足夠重視。由于BEF尚無特效藥治療，防控該病的前提條件是建立快速、準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)BEF建立了各種檢測(cè)方法，這些方法各有優(yōu)、缺點(diǎn)，如病毒分離鑒定是病原學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)耗力；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)靈敏度高、簡(jiǎn)便，常應(yīng)用于大規(guī)模檢測(cè)；分子生物學(xué)檢測(cè)方法敏感性高、特異性強(qiáng)，如RT-qPCR、RT-LAMP和RPA等檢測(cè)方法。因此，需根據(jù)實(shí)際情況選擇和結(jié)合使用不同的診斷技術(shù)，從而提高診斷該疾病的準(zhǔn)確性，為BEFV的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及進(jìn)出口檢疫提供技術(shù)保障。BEF疫苗的研發(fā)現(xiàn)已取得了諸多可觀的進(jìn)展，已開發(fā)了多種試驗(yàn)性和商業(yè)性疫苗。為得到更安全、高效、經(jīng)濟(jì)、適用性廣的BEFV疫苗，今后的研究應(yīng)側(cè)重解決減毒活疫苗毒力反強(qiáng)等問題，提高重組活載體疫苗免疫效力，提升滅活疫苗免疫持久性。