保山豬和杜洛克豬IGF-1基因的SNP篩選及生物信息學分析

李文君，富國文，龔紹榮，趙加鼎，李再磊，吳正明，周戚斌，趙桂英*

（ 1.云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201 ； 2.云南省保山市保山豬研究所，云南 保山 678200 ）

胰島素樣生長因子1（IGF-1）是胰島素樣生長因子中的一員，位于5號染色體上，是由70個氨基酸組成的單鏈堿性多肽。IGF-1長度為80 kb，包含6個外顯子，其中外顯子1、2編碼多個5'-UTR及信號肽，外顯子3、4編碼成熟蛋白肽鏈和E肽鏈的氨基酸，外顯子5、6編碼E肽羧基端延伸的16個氨基酸及相鄰的3'-UTR[1-2]。由于IGF-1在不同物種間的單核苷酸多態性不同，進而影響該基因與動物不同生產性狀間的關聯性。肖超能等[3]發現，家兔IGF-1基因的第三外顯子T365C位點上存在TT、TC和CC等3種基因型，表明IGF-1基因與家兔生長性能相關。牛志剛等[4]發現，新疆褐牛IGF-1/Sna BI位點上存在3種基因型，IGF-1/Nru I上存在兩種基因型，但與新疆褐牛的體重和體型并無相關性。許金根等[5]發現，蘇淮豬IGF-1基因的Hha I位點上存在3種基因型，其中AA型個體的育肥期平均日增重最高。李隱俠等[6]研究發現，蘇淮豬的IGF-1基因也存在3種基因型，且以AA型個體的20日齡體重最高。由此可知，IGF-1基因會在一定程度上影響豬的日增重。保山豬是云南的優良地方豬種，具有耐粗飼、適應性強、產仔數多、母豬使用年限長、肉品質好等特點，但也存在生長速度慢、平均日增重較低等不足[7]。而杜洛克豬生長速度快、平均日增重較高。本試驗選取生長性能明顯不同的兩個豬種，通過序列比對尋找IGF-1基因的單核苷酸突變位點，以進一步探究IGF-1基因對豬生長性能的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物為保山市保山豬研究所提供的保山豬和昆明正邦公司提供的杜洛克豬。

移液槍（Eppendorf公司）、電泳儀（北京六一儀器廠）、微波爐（美的微波爐電器制造有限公司）、離心機（大龍興創實驗儀器有限公司）、應變控制式無側限壓力儀（滄州虹磊公路儀器有限公司）、水浴鍋（常州隆和儀器制造有限公司）、梯度PCR儀（Applied BiosyABems公司）、電子分析天平（Sartorius有限公司）、壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）、超純水儀（成都康寧試驗專業純水設備廠）、天能凝膠成像系統（北京澎昆博遠科貿發展有限責任公司）。

瓊脂糖、TS-GelRed核酸凝膠染料、無水乙醇、DNA Markers、動物組織/細胞總DNA提取試劑盒、T3 Super PCR Mix、ddH2O、1×TAE速溶顆粒、6×Lonading Buffer均由北京擎科生物有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集采集保山豬耳組織80份、杜洛克豬耳組織30份，分別從中隨機取保山豬、杜洛克豬各10份（公、母各半）耳組織樣品用于本次試驗。采集時對豬耳進行酒精消毒，采用耳樣鉗取小塊組織，放入已滅菌的Eppendorf管中，加入75%乙醇，之后將樣品放入液氮罐中運回實驗室，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 DNA提取

利用北京擎科生物有限公司Trelief Animal Genomic DNA Kit動物基因組DNA提取試劑盒（通用型），參照說明書提取杜洛克豬和保山豬耳組織樣品DNA。將已洗脫的DNA液放入-20 ℃，保存至待送樣。

1.2.3 DNA純度和濃度檢測

使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計對DNA樣品進行測量，結果發現，所提樣品DNA濃度在30~150 μg/L之間，OD260nm/OD280nm純度值在1.7~1.9之間。

取5 μL DNA樣品原液與1 μL上樣緩沖液（Loading Buffer）混合均勻，置于1%的瓊脂糖凝膠中，并以DNA Marker（分子量為2 000 bp）作參照，在110 V恒定電壓中電泳30 min。提取后將凝膠取出，置于成像系統中，觀察DNA條帶，檢測提取成功的DNA條帶，并保存圖片。

制備濃度為1%的瓊脂糖凝膠方法：將1條速溶顆粒，用蒸餾水定容至1 L，制得1×TAE緩沖液；稱取1 g瓊脂糖放入錐形燒瓶中，量筒取TAE溶液10 mL，加入90 mL去離子水，混合后倒入錐形瓶中，搖晃均勻；加熱至煮沸，冷卻后二次加熱至完全溶解，使液體清澈透亮無明顯沉渣；將制膠框放入制膠板中，水平放置，兩端卡好，用合適大小的齒梳固定；待凝膠冷卻至可手持時，加入1~2 μL核酸染料，搖晃均勻，靜置。將液體緩慢倒入制膠塑料板中，室溫靜置至完全凝固；將膠板點樣孔放置于靠近負極一端。

1.2.4 引物設計及合成

根據杜洛克豬IGF-1基因序列（GenBank登錄號：NC_010447.5），使用Premier3.0軟件進行引物設計，利用BLAST進行分析，選取評分最高的引物送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進行引物合成。由于Exon3、Exon4、Exon6參與編碼蛋白，故后續只對上述3個外顯子進行分析。具體引物信息見表1。

表1 IGF-1基因各外顯子引物設計Tab.1 Segmental amplification primer of IGF-1 gene's each Exons

1.2.5 目的基因擴增

反應體系（25 μL）：參考北京擎科生物技術有限公司1.1×T3 Super PCR Mix試劑盒說明書，配制PCR反應液。Trans Taq PCR Super Mix溶液2.0 22 μL，forward primer、reverse primer、Template溶液各1 μL。

IGF-1基因的擴增條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，72 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，循環35次；DNA保存溫度為4~10 ℃。整個試驗過程中為避免DNA降解，對條目基因擴增的全部操作過程均需要在冰板上完成。PCR擴增體系振蕩混勻，快速分裝入PCR管，逐個加入樣品模板，蓋緊管蓋、標號，放置PCR擴增儀中進行擴增。

1.2.6 PCR產物測序及DNA序列生物信息學分析

PCR完成后，先取出5 μL產物和1 μL 6×Loading buffer，按5∶1比例混合，吹打均勻后，立即加樣并在110 V電流條件下進行試驗，在1.0%瓊脂糖凝膠中跑膠30 min后，將凝膠置于成像系統中觀察DNA條帶，選取無拖帶情況，單一且清晰的DNA條帶，送至北京擎科生物技術有限公司昆明分公司進行測序，剩余部分-20 ℃保存。

DNA序列的生物信息學分析及相應軟件見表2。

表2 生物信息學分析及相應軟件Tab.2 Bioinformatics analysis and corresponding software

2 結果與分析

2.1 保山豬、杜洛克豬樣本DNA提取結果（見圖1、圖2）

圖1 保山豬DNA提取結果Fig.1 Results of Baoshan pig DNA extraction

圖2 杜洛克豬DNA提取結果Fig.2 Results of Duroc pig DNA extraction

由圖1、圖2可知，DNA的條帶無拖帶，清晰而有條理，符合PCR擴增試驗的要求，與預期的擴增片段相符，可用于后續試驗。

2.2 保山豬、杜洛克豬IGF-1基因的PCR擴增結果（見圖3~圖5）

圖3 部分豬IGF-1基因Exon3擴增結果Fig.3 Amplification results in Exon3 of IGF-1 gene in some breeds

圖4 部分豬IGF-1基因Exon4擴增結果Fig.4 Amplification results in Exon4 of IGF-1 gene in some breeds

圖5 部分豬IGF-1基因Exon6擴增結果Fig.5 Amplification results in Exon6 of IGF-1 gene in some breeds

分別對IGF-1基因所選的3個外顯子（Exon3、Exon4、Exon6）進行擴增，各取合格的DNA提取物5~6 μL與1 μL（6×Loading buffer）混勻，經1.0%瓊脂多糖凝膠電泳。

由圖3~圖5可知，Exon3、Exon4、Exon6經PCR擴增后分別為151、182、162 bp，條帶清晰明亮，符合測序要求。

2.3 保山豬和杜洛克豬IGF-1基因SNP檢測結果（見圖6~圖10、表3）

NCBI數據庫中參考基因（登錄號：IGF-1基因NC_010447.5）CDS區所對應的Exon3、Exon4、Exon6編碼序列與本檢測結果進行序列比對，以此檢測SNP位點。

由圖6~圖10可知，在保山豬和杜洛克豬IGF-1基因的Exon3、Exon6編碼序列上均未發現突變位點。在保山豬Exon4的編碼序列上發現1個SNP位點，由G突變為A，位于189 bp處，命名為G189A。

圖6 IGF-1基因Exon3測序結果比對Fig.6 Comparison of sequencing results in Exon3 of IGF-1 gene

圖7 IGF-1基因Exon4測序結果比對Fig.7 Comparison of sequencing results in Exon4 of IGF-1 gene

圖8 IGF-1基因Exon4多態位點測序峰Fig.8 Polymorphism sequencing peak in Exon4 of IGF-1 gene

圖9 IGF-1基因Exon4氨基酸序列突變前后對比結果Fig.9 Comparison of Exon4 amino acid sequence of IGF-1 gene

圖10 IGF-1基因Exon6測序結果比對Fig.10 Comparison of sequencing results in Exon6 of IGF-1 gene

但由于密碼子具有簡并性，該突變位點未對氨基酸序列造成改變，即為同義突變，突變前后均為編碼丙氨酸（Ala）。分析統計結果見表3。

表3 IGF-1基因SNP檢測結果Tab.3 SNP test results of IGF-1 gene

2.4 保山豬IGF-1蛋白生物信息學分析

通過對保山豬和杜洛克豬測序結果比對，檢測IGF-1基因的核苷酸多態性。

由于只有保山豬在IGF-1基因編碼區發生了突變，故只針對保山豬發生的同義突變進行生物信息分析。

保山豬IGF-1基因CDS區長度為495 bp，編碼164個氨基酸，與預期的目的條帶一致，編碼蛋白的分子式為C782H1265N247O239S11，原子總數為2 544，分子量為183 03.82，理論等電點（pI）為9.89，估計半衰期為30 h，不穩定性指數為73.25（大于40），屬于不穩定性蛋白，脂肪族指數為45.30，親水性（重力）平均值為-0.957。

由表4可知，氨基酸殘基中負電荷殘基（Asp+Glu）總數為14，正電荷殘基（Arg+Lys）總數為30。20種常見氨基酸組成中精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）數目最多為15個，各占全部氨基酸組成的9.10%，色氨酸（Trp）數目最少，為0。

表4 IGF-1蛋白組成比例Tab.4 Protein composition ratio of -IGF-1 gene

2.4.1 保山豬IGF-1蛋白疏水性/親水性的分析與預測（見圖11）

由圖11可知，利用在線軟件對保山豬IGF-1蛋白的疏水性/親水性進行分析，結果為：第13位丙氨酸（Ala）疏水性最強（最高值2.756）；第154位賴氨酸（Lys）親水性最強（最低值-3.556）。其總平均值為-0.954 7，表明保山豬IGF-1基因蛋白的親水區大于疏水區，該氨酸序列親水性殘基多于疏水性殘基，親水氨基酸所占比例（65.00%），整體表現為親水性，預測此蛋白為可溶性蛋白。

圖11 保山豬IGF-1蛋白疏水性/親水分析與預測Fig.11 Analysis and prediction of hydrophobicity/hydrophilicity of IGF-1 in Baoshan pigs

2.4.2 保山豬IGF-1蛋白結構分析與預測（見圖12）

由圖12可知，保山豬IGF-1基因跨過膜外的蛋白數量為0，存在膜內蛋白結構的概率為0.227 15。預測保山豬IGF-1蛋白可能存在膜內蛋白結構，但不存在跨膜結構。

圖12 保山豬IGF-1蛋白結構預測Fig.12 Prediction of IGF-1 gene transmembrane protein structure in Baoshan pigs

2.4.3 保山豬IGF-1蛋白信號肽的分析與預測（見圖13）由圖13可知，利用在線軟件對保山豬IGF-1基因蛋白信號肽（signal peptide，SP）進行分析，發現最大C值、Y值和S值分別為0.867、0.850和0.981，D值為：0.883，存在信號肽的概率為0.999。信號肽可能在25~26位點之間，概率為0.760。預測保山豬IGF-1基因蛋白屬于分泌蛋白。

圖13 保山豬IGF-1蛋白信號肽的分析與預測Fig.13 Prediction of IGF-1 gene signal peptide in Baoshan pigs

2.4.4 保山豬IGF-1蛋白二級結構分析與預測（見圖14）由圖14可知，保山豬IGF-1蛋白由164個氨基酸組成，二級結構類型占比為：無規則卷曲99個，占60.37%；α-螺旋65個，占39.63%；無β-折疊。預測保山豬IGF-1蛋白穩定性低，保山豬IGF-1蛋白為混合型二級結構。

圖14 保山豬IGF-1基因蛋白二級結構分析預測Fig.14 Analysis and prediction of secondary structure of IGF-1 gene protein in Bao Shan pigs

2.4.5 保山豬IGF-1蛋白三維結構（見圖15）

圖15 保山豬IGF-1蛋白三維結構Fig.15 3D map of IGF-1 proteins

蛋白質的三維結構的解析對深入理解蛋白質功能和生理現象起到決定性作用，研究三級結構利于認識蛋白基本機構和預測其性質。

由圖15可知，保山豬IGF-1基因預測模型覆蓋度為0.43，序列相似度為0.63，全球模型質量估計（GMQE）可信度為0.27，GMQE評分在0~1區間內數字越大，建模可信度越高。評估待測蛋白與模板蛋白的匹配度QMEAN為-1.15，QMEAN評分越接近0，表明模型蛋白結構和相似大小的試驗蛋白結構的匹配度越好。預測該模型與保山豬IGF-1基因的蛋白結構模型具有較好的一致性。

3 討論

IGF-1基因多態性已經在多個不同的物種中得到研究，且覆蓋IGF-1基因不同區域的單核苷酸多態性位點。研究表明，IGF-1在動物生長發育中起到重要的調控作用[8]。本研究結果發現，只有保山豬在編碼蛋白的外顯子上有1個SNP位點（Exon4-G189A），而杜洛克豬沒有突變位點。保山豬的突變位點位于編碼區，雖發生了堿基突變，但所編碼的氨基酸并未發生改變，突變前后的氨基酸均為丙氨酸（Ala），故為同義突變，造成這一結果的原因可能是密碼子具有簡并性。突變位點僅出現在保山豬上，推測原因可能是杜洛克為外來豬種，與參考序列相似度高。有研究結果表明，IGF-1基因核苷酸序列相對保守，其遺傳變異具有種屬特異性[9]。Gao等[10]敲除小鼠IGF-1基因，導致小鼠肌肉發育受阻。Han[11]和Mathews等[12]研究表明，IGF-1基因可調控人和小鼠的肌肉發育過程。但IGF-1基因是否對保山豬生長和發育具有調控作用，還有待進一步進行關聯性研究。

本研究中，生物信息學分析結果顯示保山豬IGF-1基因的編碼蛋白半衰期為30 h，不穩定系數為73.25（＞40），屬于不穩定性蛋白。賈浩等[13]研究發現，蛋白質半衰期長短與其穩定性存在一定相關性，即蛋白穩定性低則半衰期短。氨基酸總平均分值是影響蛋白質的親疏水性質的主要因素，總平均分值越低，親水性越強[14]。在IGF-1基因編碼氨基酸肽鏈蛋白中，親水區占65%，且氨基酸總平均分值為-0.954 7，故推測其為可溶性蛋白質，二級結構容易親水。蛋白質的親水性/疏水性可為蛋白質跨膜區域的鑒定提供參考，氨基酸的疏水性可反映蛋白質的折疊情況，在潛在的跨膜區域會出現疏水區。本試驗中未出現跨膜區域，但存在少量的膜內蛋白區域，其無跨膜結構是否與IGF-1基因蛋白質疏水基團少有關還需進一步研究。信號肽是一段能夠引導蛋白轉移到周質空間的短肽鏈[15]。保山豬IGF-1基因編碼蛋白上有信號肽存在，且最可能出現在25~26位點之間。信號肽的H區以疏水氨基酸為主，疏水性的強弱會影響前體蛋白加工和轉運的速率[16]。IGF-1編碼蛋白為親水性蛋白，是否影響前體蛋白加工和轉運速率仍需進一步探究。

通過對蛋白二級、三級結構進行分析有助于預測蛋白質的空間結構和功能。保山豬IGF-1基因編碼的蛋白質二級結構中只存在α-螺旋和無規則卷曲，故推測該基因編碼蛋白的二級結構為混合型，其中α-螺旋占39.63%，無規則卷曲占60.37%。無規則卷曲容易受到側鏈的影響，進而改變蛋白質空間構象，導致蛋白質功能改變[17]。無規則卷曲在二級結構中所占比例較大，但是否會影響編碼蛋白的功能還需進行研究驗證。本試驗通過在線軟件建立的預測模型與IGF-1基因的蛋白模型具有一致性，但匹配度不太高，可能是由于在線軟件中可參考的數據較少，得出的最佳匹配度是與人類IGF-1基因的蛋白結構進行分析，相同基因在不同物種間的蛋白結構存在差異，若能夠參考豬IGF-1基因的蛋白結構進行分析，兩者之間的匹配度可能會進一步提高。

4 結論

本研究結果表明，IGF-1基因在物種進化過程中高度保守，使其編碼保山豬和杜洛克豬的氨基酸序列相同，蛋白質結構和功能差異很小或不存在差異，能否作為調控保山豬瘦肉少、脂肪多、生長慢的候選基因還需進行關聯性的研究加以驗證。