草魚GHR2基因生物信息學分析

李雅靖，王進千，韋姍姍，劉麗霞

（ 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030 ）

生長激素（GH）對動物生長發育和基礎代謝起到非常關鍵的作用。作為一種生物大分子，GH發揮作用的條件是必須和位于其靶細胞膜表面上的受體（GHR）進行結合。GHR是細胞因子受體超家族成員之一，屬于一種跨膜糖蛋白，需要以二聚體作為形式與GH結合，并啟動下游的磷酸化作用信號級聯反應和基因的表達[1]。GHR最初于兔子的胚肝細胞膜表面被發現，并通過試驗分離自動物體，現已成功克隆并從人類、小鼠、牛和羊的胚胎中獲得了該基因。鐘歡等[2]對奧尼羅非魚肝臟組織進行提取，轉錄測序得到相應的GHR2基因序列，并進行了表達特征分析，結果顯示，該基因與奧尼羅非魚的表達優勢和快速生長的雜種優勢密切相關。劉媛等[3]應用生物信息學與比較基因組的方法對GHR基因結構進行分析，將GHR基因作為候選基因研究其對牛生長特征產生的變化。吳雪等[4]發現，威寧綿羊各細胞中GHR基因均具有不同水平的表現，在不同年齡、不同發育時期的相同組織上的表現也不同。

生物信息學是將計算機與信息科學技術等手段運用至生命科學中，對生物的內部信息進行處理、歸納，并分析其變化規律。對生物學數據反映的生物學意義進行挖掘，可實現對生命系統的科學理解[5]。本研究對草魚GHR2基因進行生物信息學分析，并且以結果和相聯系的理論為依據，結合試驗對象的特征，在大數據的對比下對該基因的高級結構與表達特征進行預測，對闡明草魚快速生長的機制具有重要意義，為更深入地研究草魚GHR2基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列來源

從Ensembl網站獲得草魚GHR2基因編碼區序列（登錄號：ENSOABT00000046389.1）。

1.2 生物信息學軟件

對草魚GHR2基因全長序列編碼蛋白質進行生物信息學分析。所用全部網址及軟件見表1。

表1 GHR2基因生物信息學分析軟件Tab.1 Bioinformatics analysis software for GHR2 genes

2 結果與分析

2.1 草魚GHR2基因編碼蛋白質的理化性質預測與分析

蛋白質理化性質分析結果顯示，共599個氨基酸被草魚GHR2基因編碼，分子式為C3015H4674N774O909S31，相對分子質量為673 02.78 Da，理論等電點（PI）為4.89。

將該基因各氨基酸數量通過計算機以柱狀圖形式呈現，結果見圖1。

由圖1可知，含量最多的氨基酸是亮氨酸（Leu），所占氨基酸總量的11.0%；含量最少的氨基酸是色氨酸（Trp），在總數量中所占比例為1.7%。負電荷殘基總數（Asp+Glu）為75，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為46。

圖1 草魚GHR2基因編碼蛋白質的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of proteins encoded by grass carp GHR2 gene

該基因編碼產物半衰期顯示是30 h，此外由于不穩定指數為59.45（大于40.00），可知該基因編碼蛋白質屬于不穩定蛋白。

2.2 草魚GHR2基因編碼蛋白質疏水性、親水性分析

通過軟件對檢測序列中每種氨基酸的氨基酸標度數值進行分析。氨基酸標度為正值，表明氨基酸具有較大的疏水性；氨基酸標度為負值時，值越小，表明氨基酸的親水性越強。軟件分析結果圖中正值區域表示疏水區域，0值以下區域表示親水區域。通過對親水性氨基酸與疏水性氨基酸數量統計分析，可判斷該基因編碼的產物是以親水性還是疏水性為主的蛋白，還可通過軟件檢測GRAVY值的正負，對氨基酸殘基的親水性/疏水性進行判斷。

草魚GHR2基因編碼蛋白質親水性及疏水性分析結果見圖2。

由圖2可知，草魚GHR2基因編碼蛋白質位于第259位的異亮氨酸（Ile）呈疏水性最大值，為+3.178；親水性最大值為-3.133，是位于第472位的蘇氨酸（Thr）。

圖2 草魚GHR2基因編碼蛋白質疏水性/親水性預測分析Fig.2 Analysis of hydrophobic / hydrophilic prediction of GHR2 gene

統計整個編碼產品中兩種不同類型的氨基酸，親水氨基酸在全部氨基酸數量中占61.85%，疏水氨基酸所占比例是全部氨基酸數的39.15%，通過檢測的平均分呈現負值為-0.182，可預測結果顯示出親水性，草魚GHR2基因編碼中的蛋白質是親水性蛋白質。

2.3 草魚GHR2基因編碼蛋白質的N-糖基化位點預測（見圖3）

蛋白質的N-糖基化是一種常見的、涉及多種生理和病理過程的蛋白翻譯后修飾，對蛋白質功能具有調節作用。因為其對蛋白質的功能發揮非常重要，一旦出現狀況則會引起如腫瘤、自身免疫性疾病、感染等多器官系統疾病。對N-糖基化位點的鑒別是認識N-糖鏈功能的重要前提[6]。因此，對糖基化位點及該位點糖型分析具有十分重要的意義。

由圖3可知，草魚GHR2基因編碼蛋白存在7個潛在的N-糖基化位點，分別為Asn57、Asn80、Asn100、Asn141、Asn146、Asn376和Asn540。

圖3 草魚GHR2基因編碼蛋白質的N-糖基化位點預測Fig.3 N-glycosylation site prediction of grass carp GHR2 protein

2.4 草魚GHR2基因編碼蛋白質的磷酸化位點預測（見圖4）

蛋白質磷酸化作為非常關鍵的一種蛋白質翻譯后修飾，參與調節生物體內的絕大多數細胞內部的生物學過程[7]。

由圖4可知，利用相應的生物信息學軟件對草魚GHR2進行磷酸化位點預測，對預估結果進行分析，統計共有73個潛在的磷酸化位點，其中包含43個絲氨酸（S）、22個蘇氨酸（T）、8個酪氨酸（Y）。

圖4 草魚GHR2基因編碼蛋白質磷酸化位點預測Fig.4 Phosphorylation site prediction of grass carp GHR2 protein

2.5 草魚GHR2基因編碼蛋白質跨膜結構域預測（見圖5）

由圖5可知，運用TMPRED和TMHMM2.0軟件對草魚GHR2蛋白跨膜結構進行分析，結果顯示，草魚GHR2基因蛋白整體序列多數位于細胞膜表面，為跨膜蛋白。

圖5 草魚GHR2基因編碼蛋白質的跨膜結構域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of protein encoded by GHR2 gene in grass carp

2.6 草魚GHR2基因編碼蛋白質的信號肽分析（見圖6）

圖6 草魚GHR2基因編碼蛋白質信號肽分析Fig.6 Signal peptide analysis of proteins encoded proteins in GHR2 gene

信號肽是一種保守的氨基酸序列，在不同的、新產生的蛋白質N末端均存在。將新合成的蛋白轉移到具有不同膜結構的亞細胞器中，并在生物體中調控蛋白的分泌和運動[8]。通常信號肽的長度介于13~36個氨基酸殘基范圍內，以環狀構象存在的信號肽使由內質網膜中蛋白質形成的孔道打開。在信號肽的引導下，多肽鏈進入內質網中，隨后由腔表面的信號肽酶水解。

由圖6可知，GHR2基因編碼產物在第25位的得分值曲線比較有代表性，其中C值為0.33，Y值為0.562并且S值曲線較陡，表明草魚GHR2基因編碼蛋白是一種具有信號肽的蛋白，且第25號位置為信號肽剪切位點。

2.7 草魚GHR2基因編碼蛋白質二級結構和三級結構預測與分析（見圖7、圖8）

由圖7可知，草魚GHR2蛋白是由16.69%的α-螺旋（Hh），25.38%延伸鏈（Ee）和57.93%無規則卷曲（Cc）組成，以無規則卷曲為主。在二級結構的基礎上，多肽鏈通過盤旋、折疊，在次級鍵維系的基礎上產生的特定空間結構稱為三級結構[9]。

圖7 草魚GHR2蛋白質二級結構預測Fig.7 Secondary structure prediction of GHR2 protein in grass fish

由圖8可知，草魚GHR2蛋白三級結構主要由無規則卷曲構成，與對GHR2基因編碼產物的二級結構結論相符。

圖8 草魚GHR2蛋白質三級結構預測Fig.8 Prediction of triple structure of GHR2 protein in grass carp

蛋白質復雜的分子結構決定其生物學功能，而對蛋白質高級結構的定量預測研究與定量分析對進一步了解蛋白質的結構和作用關系具有十分關鍵的作用，對深入認識蛋白結構與功能之間復雜的關聯機制具有極其重要的意義[10]。

3 討論

魚類的生長受神經內分泌調節，調節魚類生長的相關激素利用激素發揮作用的特異性與位于靶細胞膜上的激素受體進行結合，在該過程中所發生的復雜反應可實現GH作用的發揮。魚類中已通過克隆得到GHR1和GHR2等兩種基因全序列，其中從奧利亞羅非魚中只獲得含有典型跨膜結構的GHR2基因序列[11]。魚類GHR基因的表達水平與自身生長、營養狀況密切相關。早期研究發現，禁食3周的大馬哈魚肝臟GHR基因的轉錄水平明顯下降，血液中GH水平顯著升高。尼羅羅非魚則主要通過與肝臟GHR1的結合促進其自身生長[12]。

大多研究通過RT-PCR的方法在不同物種的不同組織中檢測到GHR的表達。有研究顯示在魚類所有組織中，以肝臟中GHR表達量最高[13]，間接表明了GHR2基因在功能上的保守性。通過對藍太陽魚生長激素全長cDNA的克隆與序列分析，曹運長等[14]將推導出的氨基酸序列與其他動物生長激素進行了同源性比較；研究結果顯示，藍鰭鯛與大多數鱸形目魚類的生長激素具有高度的同源性（85%以上），而與其他魚類如鲇形目和魚類的同源性較低（低于70%）。劉臻等[12]利用DNAMAN軟件對13種脊椎動物的GH cDNA編碼區序列進行同源性分析，結果顯示，所克隆的鱖GH cDNA序列與同屬鱖魚的同源性高達90%以上，與不同目的魚種的同源性較低，該結果也反映了生長激素在魚類之間的高度保守性。此外，宋興超等[15]在梅花鹿GHR基因的研究中將梅花鹿與反芻動物和部分哺乳動物、鳥類、魚類進行序列相似性分析，結果也證實了這一說法。綜上所述，不同物種GHR基因編碼氨基酸序列的相似性具有相同的趨勢。

4 結論

本研究結果表明，草魚GHR2基因編碼蛋白質是由599個氨基酸組成的不穩定可溶性蛋白，PI為4.89，屬于可溶性的不穩定酸性蛋白。草魚GHR2蛋白是一種跨膜蛋白，存在信號肽，其二級結構以無規則卷曲為主，具有較多的膜信號傳導外點，影響草魚某些細胞的代謝與信號傳導過程，并且可能影響蛋白質對絲氨酸蛋白水解酶的鈍化或抑制的作用。