氣相色譜-負化學源-質譜法測定茶葉中的氟蟲腈及其代謝物

馬藝熒，郝 宇，張 鵬，劉萌萌，于 洋，孫欣瑤，于力濤,

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱商業大學旅游烹飪學院，黑龍江 哈爾濱 150028；3.綏化學院招生就業處，黑龍江 綏化 152000）

氟蟲腈是一種具有苯環結構的小分子化合物，作為一類廣譜殺蟲劑[1-2]使用，因具有殺蟲活性高、應用范圍廣的特點，被廣泛用于蔬菜、水果等[3-4]農產品領域，故其可通過食物鏈生物積累進入生物體內。研究表明，短期攝入大量氟蟲腈可能出現惡心、嘔吐、腹痛等急性中毒癥狀，同時會對神經系統造成損傷；長期攝入可能損害肝、腎、甲狀腺等[5-6]器官組織，甚至產生生殖及發育毒性[7-9]。同時由于在自然環境中氟蟲腈可降解為氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜，且其3 種代謝產物毒性均高于氟蟲腈，并易儲存于富含脂質的組織，對人體健康具有更大的威脅[10]。世界衛生組織將氟蟲腈列為對人類有中等毒性化學品[11]。

中國是茶葉的發源地，是世界上第一產茶大國，生產的茶葉種類主要有紅茶、綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶和黑茶六大類。茶作為一種健康飲品，茶葉的品質尤為重要。茶樹適宜生長在地勢高、濕度大的地區，茶葉在生長過程中易出現病蟲害，使用氟蟲腈殺蟲劑成為控制其危害茶樹的主要手段，與此同時茶葉農藥殘留問題也日益嚴重。2006—2014年，我國出口到日本的烏龍茶和綠茶因農藥殘留超標分別被通報87 次和12 次，其中氟蟲腈超標被通報22 批次，占被通報總次數的22%[12]。2017年，我國出口烏龍茶被日本通報氟蟲腈超標，檢出量為0.009 mg/kg，超出了日本對茶葉中氟蟲腈的限量0.002 mg/kg[13]。歐洲食品安全局規定雞蛋中的氟蟲腈最高限量為0.01 mg/kg；GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》規定水果、蔬菜、蛋類中的氟蟲腈最大限量為0.005～0.02 mg/kg，小麥、大麥、燕麥等谷物的氟蟲腈最大限量為0.002 mg/kg；歐盟委員會規定氟蟲腈在谷物、蔬菜、茶葉等食品中的限量為0.005 mg/kg。因此建立高效、快速、準確的茶葉中氟蟲腈及其代謝物檢測方法，對茶葉中的氟蟲腈及其代謝物殘留的監測具有重要意義。

目前，食品中氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜法[14-16]、液相色譜法[4,17-18]、液相色譜-串聯質譜法[19-20]、氣相色譜-串聯質譜法[21-24]等。其中氣相色譜-串聯質譜法是氟蟲腈的主要定量分析方法，具有檢測線性關系良好、分析定性及定量準確等優點，是目前較理想的檢測方法[25-26]。尤其是氣相色譜-負化學源-質譜法，具有離子碎裂少、響應值高[27]、抗干擾能力強的優點，在農殘藥殘的檢測中有廣泛應用[5]，而其在茶葉中檢測氟蟲腈及其代謝物的報道較少。因此，本實驗對茶葉氟蟲腈及其代謝物中樣品處理條件：提取劑的選擇、提取劑的用量和凈化柱的選擇進行研究，從而建立一種適合測定茶葉中氟蟲腈及其代謝物含量的氣相色譜-負化學源-質譜法，并使用建立的方法測定市售茶葉中的氟蟲腈及其代謝物，該方法穩定性和重復性良好、準確度和靈敏度高，能為茶葉的質量安全控制提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉30 份：綠茶10 份、紅茶10 份、烏龍茶5 份、黑茶5 份均為市售。

標準品：氟蟲腈（CAS號：120068-37-3，100 μg/mL）、氟甲腈（CAS號：205060-65-3，100 μg/mL）、氟蟲腈砜（CAS號：120068-36-2，100 μg/mL）、氟蟲腈亞砜（CAS號：120067-83-6，100 μg/mL） 北京壇墨質檢科技有限公司；乙腈、丙酮、正己烷、甲醇（均為殘留級），氯化鈉（優級純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；CNWBOND PSA SPE Cartridge（PSASPE柱）（規格為500 mg/6 mL）、CNWBOND Carbon-GCBSPE Cartridge（GCB-SPE 柱）（規格為500 mg/6 mL）、0.22 μm針式過濾器（有機相） 上海安譜實驗科技股份有限公司；SUPELCLEAN ENVI-18（ENVI-18-SPE柱）（規格為500 mg/6 mL） 默克化工技術（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

8890-7000D三重四極桿氣相色譜-質譜聯用儀（配化學源及Mass hunter數據處理系統）、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技有限公司；FS-100粉碎機 華能科技有限公司；Dynamica VELOCITY 18R高速臺式離心機 上海馭锘實業有限公司；MMS-520·5020型振蕩器 東京理化有限公司；T 10 basic ULTRA-TURRAX?均質器 德國IKA公司；LabTech H150-100LT旋轉蒸發儀 萊伯泰科儀器股份有限公司；TTL-DCII?氮吹儀 北京同泰聯科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別移取氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標準品1 mL，用丙酮分別定容到10 mL，配制質量濃度為10 μg/mL的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標準儲備溶液，-18 ℃貯存備用。分別取上述溶液0.2 mL，用丙酮-正己烷（3∶7，V/V）定容到10 mL，充分混勻，配制成質量濃度為0.2 μg/mL的標準混合使用液。

1.3.2 樣品處理

取茶葉樣品500 g，用磨碎機全部磨碎，并通過2.0 mm圓孔篩，混勻，放入密封瓶中備用。

稱取2.0 g茶葉樣品，加入10 mL水混勻，再加入20 mL乙腈，高速勻漿提取2 min，再加入1 g氯化鈉，400 r/min劇烈振蕩20 min，5000 r/min離心10 min，待凈化。

取10 mL上層提取液至50 mL具塞離心管中，加入10 mL正己烷，振搖3 min，靜置分層后棄去上層正己烷相，再加入10 mL正己烷重復操作1 次；將下層乙腈相轉移至濃縮瓶中，40 ℃旋轉蒸發至近干，加入1.0 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）溶解。

使用5 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）活化PSA-SPE柱。將樣液傾入PSA-SPE柱中，用10 mL丙酮-正己烷（3∶7，V/V）進行洗脫，控制流速不大于2 mL/min。收集全部洗脫液于濃縮瓶中，40 ℃氮吹至近干，用丙酮-正己烷（3∶7，V/V）溶解并定容至1.0 mL，使用0.22 μm濾膜針頭濾器過濾后裝入進樣瓶，待測定，每個樣品平行測定3 次。

1.3.3 系列標準工作液的配制

分別取適量氟蟲腈及其代謝物標準混合使用液，用丙酮-正己烷稀釋，配制成質量濃度為0.002、0.010、0.050、0.100、0.200 μg/mL的氟蟲腈及其代謝物系列標準工作液。

1.3.4 色譜條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度70 ℃，保持0 min，然后以30 ℃/min升溫至200 ℃保持10 min，再以50 ℃/min升溫至270 ℃保持4 min；接口溫度280 ℃；進樣量1 μL；進樣方式為不分流進樣；流量1 mL/min。

1.3.5 質譜條件

電離方式：負化學電離；離子源溫度150 ℃；四極桿溫度150 ℃；反應氣：甲烷；測定方式：選擇離子監測方式；溶劑延遲6 min。4 種目標物的檢測參數見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物的檢測參數Table 1 Mass spectrometric parameters for fipronil and its metabolites

1.4 數據處理

采用氣相色譜-質譜聯用儀配備的定量分析軟件Mass hunter、Microsoft Excel和Origin 2021對檢測結果進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

常見的提取劑有甲醇、丙酮、乙腈和正己烷等[21]。由于加入氯化鈉后甲醇與水相分層效果不明顯。故選擇丙酮、乙腈和正己烷為提取劑，以加標量為0.010 mg/kg的空白茶葉樣品為研究對象，提取劑添加量為20 mL，經過PSA-SPE柱凈化，進行氟蟲腈及其代謝物的提取效果的研究，結果見表2、圖1。

表2 不同提取劑對氟蟲腈及其代謝物的提取效果Table 2 Extraction efficiencies of different solvents for fipronil and its metabolites

圖1 不同提取劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響Fig.1 Effects of different extractants on the recoveries of fipronil and its metabolites

結果表明，當4 種目標物添加量為0.010 mg/kg，丙酮提取目標物時，其對4 種目標物的提取回收率為85.23%～90.70%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）不大于5.87%；乙腈對4 種目標物的提取回收率為96.00%～98.52%，RSD不大于3.00%；正己烷對4 種目標物的提取回收率為89.34%～95.75%，RSD不大于5.92%。由此可見使用乙腈作為提取劑時目標物的回收率均高于使用丙酮和正己烷作為提取劑時目標物的回收率，差異顯著（P＜0.05），這是由于乙腈極性大、穿透性強，與4 種目標物極性更相似，故乙腈的提取率最高[28]。

2.2 提取劑的用量

分別添加5、10、15、20、25、30、35 mL乙腈對加標量為0.200 mg/kg的空白茶葉樣品中4 種目標物進行提取，經過PSA-SPE柱凈化，結果見圖2。

圖2 不同提取劑用量對氟蟲腈及其代謝物的提取效果Fig.2 Effect of acetonitrile dosage on the recoveries of fipronil and its metabolites

由圖2可以看出，隨著乙腈添加量的增加，4 種目標物的響應值也不斷增加，當乙腈添加量為20 mL時，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜響應值達到最大，且隨著乙腈用量繼續增加，4 種目標物的響應值與乙腈添加量為20 mL時相當，這說明在乙腈添加量為20 mL時4 種目標物能被完全提取出來，故選擇20 mL作為提取劑的最適用量。

2.3 凈化柱的選擇

PSA可吸附蛋白質、色素以及極性較高的酸性物質[29]。C18可除去脂類、花青素、蠟質等物質，GCB可除去葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等色素和甾醇等[19]。以加標量為0.010 mg/kg的空白茶葉樣品為研究對象，對比3 種凈化柱對氟蟲腈及其代謝物的凈化效果，結果見圖3。

圖3 ENVI-18-SPE柱（A）、GCB-SPE柱（B）和PSA-SPE柱（C）凈化氟蟲腈及其代謝物的色譜圖Fig.3 Chromatograms of fipronil and its metabolites purified by ENVI-18-SPE cartridge (A),GCB SPE cartridge (B) or PSA SPE cartridge (C)

結果顯示，3 種小柱均可起到凈化的效果，但經ENVI-18-SPE柱凈化后的4 種目標物，雜質峰較多，且響應值較高，對目標化合物檢出限附近濃度影響較大，這是由于茶葉樣品經其凈化后還殘留其他雜質。GCB-SPE柱凈化后的4 種目標物存在被吸附的現象，響應值均低于其他2 種凈化柱的凈化結果。PSA-SPE柱凈化的4 種目標物分離效果較好，響應值較高，故選擇PSA-SPE柱。

2.4 標準曲線和線性關系

由圖4可知，4 種目標物在16 min內可以完全分離，分離效果好，達到了基線分離。

圖4 氟蟲腈及其代謝物的標準圖譜Fig.4 Chromatogram of standard mixture of fipronil and its metabolites

以氟蟲腈及其代謝物系列標準工作液質量濃度為橫坐標，響應值為縱坐標繪制標準曲線，得出線性范圍；采用空白樣品添加目標化合物的方法，選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標化合物，添加水平為0.002 mg/kg，平行測定10 次，根據信噪比法，典型可接受的信噪比為2∶1或3∶1[30]，本方法將平均信噪比為10∶1時的含量作為檢出限，結果見表3。

表3 氟蟲腈及其代謝物的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations of fipronil and its metabolites

由表3可知，4 種目標物在0.002～0.200 μg/mL范圍內線性良好，相關系數R2大于0.999，響應值和氟蟲腈及其代謝物含量之間具有顯著的線性相關性。檢出限均為0.002 mg/kg，該方法靈敏度高，可以滿足氟蟲腈及其代謝物測定的要求。

2.5 重復性、精密度及正確度

選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標化合物，添加量分別為0.010、0.050 mg/kg和0.100 mg/kg，平行測定7 次，RSD小于5%，表明該方法重復性良好，精密度良好，達到分析要求，結果見表4。

表4 精密度實驗結果（n=7）Table 4 Results of precision tests (n =7)

選取同一空白茶葉樣品，向其添加目標化合物，以檢出限的1、5 倍和10 倍，在線性范圍內選取0.002、0.010 mg/kg和0.020 mg/kg三個添加水平，每個樣品進行3 次平行測定，得各水平加標回收率在96.33%～102.50%之間，符合檢測方法確認的技術要求[31]，結果見表5。

表5 正確度實驗結果（n=3）Table 5 Results of spiked recovery tests (n=3)

2.6 樣品測定

使用本研究建立的氣相色譜-負化學源-質譜法對30 份不同種類、不同批次的市售茶葉進行檢測分析，并對烏龍茶中未檢出樣品進行加標回收測試，理論加標值為0.020 mg/kg，結果見表6。

表6 不同市售茶葉的氟蟲腈及其代謝物含量Table 6 Results of determination of fipronil and its metabolites in different types of commercial tea by GC-NICI-MS

由表6可知，30 份茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物檢出率為6.67%，其中10 份綠茶中有1 批次氟蟲腈含量為（0.003±0.001）mg/kg，10 份紅茶中有1 批次氟蟲腈砜含量為（0.004±0.001）mg/kg，5 份烏龍茶和5 份黑茶中未檢出氟蟲腈及其代謝物，加標回收實驗回收率較好，說明本次市售茶葉檢測實驗正確度較好，數據可信度高。

檢出樣品中氟蟲腈及其代謝物總量（以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜之和計）高于日本規定的茶葉中氟蟲腈的最大殘留量0.002 mg/kg，但未達到歐盟規定蔬菜中氟蟲腈的最大殘留量0.005 mg/kg。GB 2763—2021《食品中農藥最大殘留限量》中，未對茶葉中氟蟲腈及其代謝物做出限量規定，表明其作為農藥禁止在茶葉中使用。鑒于氟蟲腈對甲殼類水生生物和蜜蜂具有較高風險，在水和土壤中降解慢，我國在2009年就對其限制使用[32]，只允許衛生用或作為部分旱田種子包衣劑使用。茶葉樣品中氟蟲腈及其代謝物的檢出，可能存在茶農非法使用氟蟲腈的現象，亦或是氟蟲腈被施用后，對環境造成污染，從而被茶樹吸收，導致茶葉中檢出氟蟲腈及其代謝物。針對該現象，國家應加強對氟蟲腈的管理，如對食品中氟蟲腈及其代謝物進行定期抽檢和風險評估，同時還應對環境中氟蟲腈及其代謝物的污染進行監測，加強監管，引導農民科學選購與使用農藥，確保農業生產、環境及食品安全。

茶葉中氟蟲腈及其代謝物超過最大殘留量也不能說明其對人體有高暴露風險，應結合不同人群實際飲茶量和沖泡方式進行綜合分析，可根據泡茶工藝展開研究并進行暴露分析。

3 結論

本研究建立的氣相色譜-負化學源-質譜法適用于茶葉中氟蟲腈及其代謝物：氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的測定。該方法線性范圍較廣、重復性好、準確性高，能快速簡便的對茶葉中氟蟲腈及其代謝物進行檢測分析。使用本研究建立的氣相色譜-負化學源-質譜法測定不同市售茶葉中氟蟲腈及其代謝物，結果準確、回收率高，能準確反映市售茶葉被氟蟲腈及其代謝物的污染情況，在氟蟲腈及其代謝物痕量檢測領域可廣泛應用。