SPOCK1、MMP11與MMP9在結直腸癌中的表達及臨床價值

史春桃，程 杰，劉 慧，單永鋒，王昊楠△

(1.無錫市錫山人民醫院普外科，江蘇無錫 214000；2.無錫市第五人民醫院腫瘤科，江蘇無錫 214000)

結直腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，因其高死亡率嚴重危害人類的生命健康[1]。新型生物標志物的挖掘為預測和改善結直腸癌患者預后帶來了可能[2]。SPOCK1是一種首次從人類睪丸中分離出來的蛋白多糖，屬于一個新的Ca2+結合蛋白多糖家族，其高表達在促進結直腸癌發生、發展中具有重要意義[3-4]。有研究發現，SPOCK1能通過調控基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)水平在疾病的發生中發揮重要作用，其中包括促進惡性腫瘤的侵襲與轉移[5-6]。因此，本研究旨在分析SPOCK1、MMP11與MMP9在結直腸癌組織和正常組織中的表達及相關性，評估三者單獨與聯合檢測在評估結直腸癌臨床病理特征中的價值。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取2012年1月至2019年12月于無錫市錫山人民醫院行結直腸癌根治術的70例患者，年齡(66.17±12.29)歲，男女比例為1∶1.12。所有患者術前均未接受任何放化療，術后病理結果經2名以上病理醫師確認，并有完整的臨床病例資料。

1.2 主要試劑

兔抗人SPOCK1多克隆抗體(ab229935)、兔抗人MMP11多克隆抗體(ab119284)及兔抗人MMP9單克隆抗體(ab76003)購自英國Abcam公司；SP試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1數據庫分析

本研究選取TIMER2.0和GEPIA數據庫檢測SPOCK1與MMPs在結直腸癌組織中的表達及相關性。利用TIMER數據庫分析SPOCK1與MMPs表達在惡性腫瘤中的相關性，挑選出與SPOCK1表達呈正相關的MMPs；運用GEPIA數據庫分析MMPs在結直腸癌組織與正常組織中的表達差異，并分析SPOCK1與MMPs表達相關性。

1.3.2免疫組織化學法檢測SPOCK1、MMP11及MMP9表達

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP法)檢測SPOCK1、MMP11及MMP9表達。將切片脫蠟水化、高溫高壓抗原修復。然后滴加Solution A液室溫孵育10 min，PBS充分淋洗，再滴加Solution B液室溫孵育10 min后甩干。配制一抗工作液，SPOCK1與MMP11抗體稀釋度為1∶100，MMP9抗體稀釋度為1∶1 000。滴加適量一抗工作液，孵育切片標本過夜后PBS淋洗。滴加Solution C液室溫孵育10 min，再滴加Solution D液室溫孵育10 min，PBS 充分淋洗。DAB顯色，鏡下觀察后復染、脫水、封片。

1.3.3結果判定

免疫組織化學染色結果基于染色強度和陽性細胞數兩項指標。染色強度分級評分：0分，無著色；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，強染色。陽性細胞數比例評分：0分，陽性細胞0；1分，陽性細胞<25%；2分，陽性細胞25%～<50%；3分，陽性細胞50%～75%；4分，陽性細胞>75%。染色評分(immunoreactive score，IRS)=染色強度評分×陽性細胞數比例評分，總分<4分為陰性，≥4分為陽性。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 臨床樣本分析SPOCK1在結直腸癌組織與正常組織中的表達

SPOCK1主要位于細胞質內，并且在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織(t=7.319，P<0.001)，見圖1。

A：SPOCK1在結直腸癌組織中的表達；B：SPOCK1在結直腸正常組織中的表達；C：SPOCK1在結直腸癌組織與正常組織中的表達差異分析。

2.2 數據庫挖掘結直腸癌組織中與SPOCK1表達相關的MMPs

TIMER 2.0數據庫分析發現，包括MMP1、MMP2、MMP9等13種MMPs在結直腸癌中與SPOCK1表達呈正相關，見圖2。GEPIA數據庫分析發現，僅有5種MMPs在結直腸癌組織中表達明顯高于正常組織，包括MMP1、MMP7、MMP9、MMP11和MMP12，且與SPOCK1表達均呈正相關，見圖3。結合2個數據庫分析，最終確定MMP11和MMP9在結直腸癌組織中表達與SPOCK1最為密切。

圖2 TIMER2.0數據庫分析 SPOCK1與MMPs表達相關性

2.3 臨床樣本分析SPOCK1、MMP11與MMP9表達相關性

MMP11與MMP9均表達在細胞質內(圖4A)，且在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織(P<0.001，圖4B)。二者均與SPOCK1表達呈正相關，且二者之間也呈正相關(圖4C)。

圖3 GEPIA數據庫分析結直腸癌組織中5種MMPs與SPOCK1表達相關性

2.4 SPOCK1、MMP11、MMP9表達與結直腸癌臨床病理學參數的關系

根據免疫組織化學結果將70例患者進行分組：SPOCK1陽性組54例，陰性組16例；MMP11陽性組50例，陰性組20例；MMP9陽性組49例，陰性組21例。結合臨床病理特征分析發現，SPOCK1表達與淋巴結轉移、TNM分期相關(P<0.05)；MMP11表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)；MMP9表達與分化程度、淋巴結轉移、TNM分期相關(P<0.05)，見表1。三者均陽性與結直腸癌腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)，見表1。

表1 SPOCK1、MMP11與MMP9在結直腸癌中表達與臨床病理參數的關系

A：MMP11和MMP9在結直腸癌組織與正常組織中的表達；B：MMP11和MMP9在結直腸癌組織與正常組織中的表達差異分析；C：SPOCK1、MMP11、MMP9相關性分析。

3 討 論

由于結直腸癌具有高發生率和高死亡率，其一直以來都在威脅著人類生命健康[7]。盡管除了手術，還有化療、放療、靶向治療等多種治療手段能夠治療結直腸癌，但許多患者在初診時即有轉移跡象，屬于晚期階段，5年生存率較低[8]。病理學的發展和生物標志物的挖掘，能夠更好地分析結直腸癌等惡性腫瘤的習性和確認病理特征[9]。常見的結腸癌相關腫瘤標志物有癌胚抗原、糖類抗原CA199和糖類抗原CA724等[10]。然而，這些標志物特異性不強，靈敏度不高，對腫瘤早期病理診斷和預后評估作用并不明顯[11]。因此，挖掘新型生物標志物成為預測與改善結直腸癌患者預后的重要方向。

SPOCK1屬于新發現的Ca2+結合蛋白多糖家族成員之一，此家族的共同特點是有相似的N端、C端及含有卵泡素樣結構的區域，參與細胞的增殖、黏附及轉移等生理與病理過程[4]。研究發現，該家族的多個成員，包括SPARC、SPARCL1等的異常表達通過調節腫瘤增殖、黏附及基質間互作在結直腸癌發生、發展過程中起到了重要作用[12-13]。SPOCK1與SPARC在結構上有極高的相似性[14]。近年來文獻表明，SPOCK1還廣泛參與腫瘤的發生與發展，在癌細胞間質重構中起到重要的調節作用，從而促進癌細胞生長、侵襲與轉移[15]。研究發現，SPOCK1的功能受其分解的多糖片段影響，這些片段能夠特異性地與生長因子、趨化因子和基質結構等結合，癌細胞則通過吸收這些片段獲得生長優勢，進一步增強侵襲作用[16]。本研究發現，SPOCK1在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織，且與淋巴結轉移和TNM分期相關，表明異常高表達的SPOCK1在結直腸癌發生、發展與轉移過程中發揮著關鍵作用。

上皮間質轉化(epithelial-mes-enchymal transition，EMT)在腫瘤的侵襲和轉移中發揮至關重要的作用，MMPs則與EMT的發生密切相關[17]。相關研究表明，SPOCK1可通過調控EMT促進腫瘤侵襲與轉移，而沉默SPOCK1不僅會使腫瘤細胞侵襲轉移能力與EMT的發生明顯受抑，還能明顯下調MMPs表達[5]。因此，異常高表達的SPOCK1可通過上調MMPs誘導EMT發生，進而促進結直腸癌的發生、發展與轉移。本研究首先通過數據庫確認與SPOCK1表達呈正相關的MMPs，其中包括MMP11、MMP9在內的13種MMPs，但僅5種在結直腸癌組織中表達明顯高于正常組織。通過數據庫分析，最終確定在結直腸癌中MMP11和MMP9是與SPOCK1最為密切的MMPs。免疫組織化學檢測同樣發現，三者在結直腸癌組織中的表達明顯高于正常組織，且三者之間呈正相關。不僅如此，三者表達均與臨床病理學參數相關，但各自存在差異，并且當三者均為陽性時，預示結直腸癌惡性程度更高、分期更晚。故三者聯合檢測對于臨床病理學的診斷具有強化作用。這也為證明SPOCK1通過上調MMPs促進結直腸癌發生、發展的作用提供臨床依據。

綜上所述，SPOCK1、MMP11和MMP9在結直腸癌組織中表達明顯高于正常組織，三者間呈正相關；SPOCK1、MMP11和MMP9聯合檢測對患者臨床病理特征具有指導價值，并為尋找結直腸癌潛在的靶點提供良好的理論基礎。