IDH1突變對腦膠質(zhì)瘤微血管密度的影響

李 茜,林 勇,馮瓊瑤

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，重慶 400038)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，其分類主要依賴于光學(xué)顯微鏡下蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組織化學(xué)染色顯示相關(guān)蛋白質(zhì)和部分超微結(jié)構(gòu)特征。隨著對腦腫瘤發(fā)生的遺傳學(xué)基礎(chǔ)逐步闡明，基因表型將有助于針對腦腫瘤的分類。2016年修訂版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類打破了完全基于顯微鏡下診斷的百年診斷原則，將基因表型加入中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中。2021 年出版的WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類將眾多分子改變與臨床病理學(xué)應(yīng)用結(jié)合起來，進一步推進分子診斷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中的重要作用。其中異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)突變，無論在第4版還是第5版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，都體現(xiàn)了重要的作用[1]。

IDH是由普遍存在于人和真核生物中的異檸檬酸脫氫酶基因編碼的蛋白酶。IDH包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+，輔酶Ⅱ)依賴的 IDH1和IDH2及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，輔酶Ⅰ)依賴的IDH3，其主要功能是在三羧酸循環(huán)中催化異檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)，同時產(chǎn)生NAD+/NADP+。IDH突變中90%以上為IDH1突變，因此本研究主要關(guān)注IDH1突變。IDH1突變一般定位于4號外顯子上，位于第395位的堿基突變，導(dǎo)致與異檸檬酸鹽(isocitrate,ICT) 結(jié)合部位的132位點區(qū)域單個氨基酸的改變。目前，有6種R132 位點突變存在：R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R132V。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中最常見的突變(>90%)是IDH1的R132堿基G和A的替換，導(dǎo)致精氨酸被組氨酸取代(CGT-CAT)。IDH1突變是彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤一個重要的預(yù)后因子，IDH1突變的膠質(zhì)瘤患者具有更好的放化療敏感性，更長的無進展生存期(progression free surviva,PFS)和總生存期(overall survival,OS)[2-3]，IDH1突變與預(yù)后的具體作用機制仍不清楚。膠質(zhì)瘤血管豐富，形態(tài)多樣，膠質(zhì)瘤微血管密度(microvessel density,MVD) 也是重要的腫瘤預(yù)后指標(biāo)[4]。本研究探討IDH1突變與腦膠質(zhì)瘤MVD的關(guān)系，分析其在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013-2015年陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)病理證實的208例患者膠質(zhì)瘤標(biāo)本，患者知情同意。鑒于WHO(2016)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類應(yīng)用的廣泛性，本研究仍然應(yīng)用該分類標(biāo)準(zhǔn)進行分級。WHO Ⅰ級8例，Ⅱ級79例，Ⅲ級56例，Ⅳ級 65例。Ⅱ級中彌漫性星形細(xì)胞瘤41例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤20例，少突星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤18例；Ⅲ級的間變性星形細(xì)胞瘤28例，間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤17例，間變性少突星形細(xì)胞瘤11例。

1.2 方法

1.2.1IDH1基因突變檢測

按照DNA提取試劑盒(美國Promega公司)說明提取DNA，核酸定量儀測定DNA濃度后進行PCR擴增。PCR前向引物：5′-ACC AAA TCG GCA CCA TAC GA-3′，反向引物：5′-TTC ATA CCT TGC TTG CTT AAT GGG TGT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)30次，最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定合格后將DNA樣品送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色及MVD檢測

將石蠟包埋的組織塊切片，一張采用HE染色復(fù)核病理分級，另一張用于CD31 免疫組織化學(xué)染色(即用型，50 μL，MAB-0031，邁新生物技術(shù)有限公司)。CD31染色采用SP法，嚴(yán)格按照說明書步驟操作。CD31陽性表達在顯微鏡下表現(xiàn)為微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色或棕色。按照Weidner提出的血管計數(shù)方法計數(shù)MVD：低倍鏡下選擇5個陽性染色最多的熱點，用高倍鏡(×200)在眼網(wǎng)格下0.25 mm2范圍內(nèi)計數(shù)，任何管腔或單一血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色作為1個微血管，5個高倍鏡視野下計數(shù)的微血管平均值作為此標(biāo)本的MVD[5]。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中 (含 100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素，美國Thermo Fisher公司),37 ℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.2.4質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

IDH1R132H突變質(zhì)粒(Mut)及對照質(zhì)粒(Mock)購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)測序確定。按照脂質(zhì)體2000說明書將IDH1-Mut質(zhì)粒及IDH1-Mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入U87細(xì)胞。48 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并利用流式細(xì)胞儀對GFP陽性細(xì)胞進行分選。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達

使用RIPA全細(xì)胞裂解液提取經(jīng)分選的GFP陽性細(xì)胞總蛋白，lowry法進行蛋白定量。將等量蛋白進行SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用含5% BAS的TBST緩沖液封閉2 h。將一抗β-actin (1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司)，鼠抗人IDH1單抗(1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司)，鼠抗人IDH1-Mut單抗(1∶500，德國Dianova公司)用抗體稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，在4 ℃下與封閉好的膜孵育過夜。洗膜后將二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)，1∶1 000，A0216，碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)，1∶1 000，A0208，碧云天生物技術(shù)有限公司]室溫孵育1 h后，使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)儀(美國Pierce公司)顯影，應(yīng)用Image LabTM (美國Bio-Rad公司)軟件分析。

1.2.6ELISA檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平

將相同數(shù)量的U87-IDH1-Mut及U87-IDH1-Mock細(xì)胞培養(yǎng)，于培養(yǎng)后21 h、22 h、23 h、24 h收集培養(yǎng)基上清液，設(shè)定空白對照。ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)檢測上清液中VEGF水平，按照說明書操作，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度(A450)值。每份標(biāo)本重復(fù)檢測3次，每次設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.7細(xì)胞增殖實驗

將細(xì)胞消化后按1×104個/孔接種于96孔板。24 h后每孔加入10 μL CCK8(瑞士Roche Biochemicals公司)，在37 ℃孵箱培養(yǎng)1 h后檢測A450值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 IDH1突變情況

膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IDH1突變是R132 位點堿基的替換，因此所有病例進行基因測序，并與IDH1基因進行比對。比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)：208例病例中IDH1突變79例，均為第395位的鳥嘌呤堿基突變?yōu)橄汆堰?。突變主要發(fā)生在WHO Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤中，突變率分別為56.96%和55.36%，各亞型突變具體情況見圖1。8例WHO Ⅰ級毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤病例未檢測到突變。65例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中檢測到3例IDH1突變，且為原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

圖1 不同級別膠質(zhì)瘤IDH1突變情況

2.2 IDH1突變膠質(zhì)瘤中MVD

采用CD31的免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色，見圖2A，在IDH1野生型膠質(zhì)瘤中MVD隨著膠質(zhì)瘤級別增加而增加。在相同級別中，IDH1突變型膠質(zhì)瘤的MVD較IDH1野生型降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2B。

2.3 建立IDH1R132H突變細(xì)胞系

將IDH1-Mut質(zhì)粒及IDH1-Mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入U87細(xì)胞(圖3A)。在IDH1-Mut中，檢測出IDH1突變型蛋白，而IDH1-Mock中未能檢測出IDH1突變型蛋白，表明在細(xì)胞系中成功轉(zhuǎn)染了IDH1-Mut質(zhì)粒，見圖3B。

A：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；B：蛋白印跡圖。

2.4 IDH1突變對膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF水平的影響

隨著時間的延長，VEGF在兩組中逐漸增加，并且IDH1-Mut的VEGF水平明顯低于IDH1-Mock(P<0.05)，見圖4A。為了排除IDH1突變通過抑制細(xì)胞增殖，來降低VEGF分泌，利用CCK8檢測了兩組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示在24 h內(nèi)，細(xì)胞增殖無明顯變化(P>0.05)，見圖4B。

A：ELISA檢測VEGF水平；B：CCK8檢測細(xì)胞增殖。

3 討 論

自2008年P(guān)ARSONS等[6]首次報道IDH1/2突變以來，其已迅速成為膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)的新焦點。有研究者采用直接測序法對IDH1/2突變在不同類型和級別腦腫瘤中的分布進行研究發(fā)現(xiàn)，IDH1/2突變主要發(fā)生在WHO Ⅱ、Ⅲ級的膠質(zhì)瘤和WHO Ⅳ級的繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，有研究報道在彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中IDH1/2突變率超過70%，在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變性星形細(xì)胞瘤中突變率也高達62%～80%，在繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為76%，而在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤突變率為5.6%[7-8]。由于IDH1在膠質(zhì)瘤中突變率達到90%以上，因此本研究主要檢測了IDH1突變。方法學(xué)上，二代基因測序在膠質(zhì)瘤治療中的臨床價值逐漸凸顯[9]。本文關(guān)注的是單一基因，因此采用的是直接測序法。本研究在WHOⅠ級膠質(zhì)瘤中未檢測到突變，在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中突變率僅為4.62%，與已有研究報道一致。IDH1突變主要發(fā)生在WHO Ⅱ級和Ⅲ級膠質(zhì)瘤中，突變率分別為56.96%和55.36%，與文獻[10]一致。對于成人型彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤在2021年第5版分類中，所有IDH突變的彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤都被視為單一類型(星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤IDH突變型)，然后被分級為WHO Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ級。而對于IDH野生型膠質(zhì)瘤，將TERT 啟動子突變、表皮生長因子(EGFR)基因擴增、整個7號染色體的獲得與整個10號染色體的缺失[+7/-10]這3個參數(shù)作為IDH 野生型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)。凸顯出IDH在成人彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的重要地位。

IDH1突變是膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期事件。其致瘤機制可能是在IDH1突變細(xì)胞中，IDH1催化異檸檬酸生成α-KG的作用降低，從而影響α-KG 依賴性脯氨酰羥化酶(prolyl hydroylase，PHD) 對缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α) 的降解。α-KG大量降低后，PHD活性受到抑制，HIF-1α在胞內(nèi)聚集。HIF-1α 是低氧狀態(tài)轉(zhuǎn)錄的重要蛋白，能增加下游VEGF，刺激血管形成，并參與部分信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子的表達調(diào)控，刺激膠質(zhì)瘤的發(fā)生[11]。還有一些關(guān)于IDH1突變致瘤機制的假設(shè)，包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化還原電位相關(guān)機制，CpG島甲基化相關(guān)的表觀遺傳機制等。按照假說，在IDH1突變患者中，HIF-1α在胞內(nèi)聚集致VEGF增多，促進腫瘤血管生成能力增強，腫瘤增殖更快，預(yù)后差。但事實上IDH1突變是一個預(yù)后良好的指標(biāo)，IDH1突變型膠質(zhì)瘤患者復(fù)發(fā)時間較野生型患者明顯延長，對放化療敏感，預(yù)后好，但其機制目前尚未明確。IDH1突變使細(xì)胞生成α-KG的能力降低，但導(dǎo)致羥戊二酸(R-2-hydroxyglutarate，R-2HG)在細(xì)胞內(nèi)大量聚集[12]。KOIVUNEN等[13]發(fā)現(xiàn)R-2HG促進Eg1N脯氨酰羥化酶活性，導(dǎo)致HIF-1α水平降低。CHESNELONG等[14]也發(fā)現(xiàn)在IDH1突變膠質(zhì)瘤組織及其來源的腫瘤干細(xì)胞中，HIF-1α的應(yīng)答基因包括糖酵解的基因(SLC2A1、PDK1、LDHA、SLC16A3)表達水平降低，提示IDH1突變使膠質(zhì)瘤對糖代謝能力降低，可能是腫瘤生長緩慢的原因之一。本研究表明，隨著膠質(zhì)瘤級別的增加，MVD隨之增加，同時在相同級別的IDH1突變型患者中MVD較野生型患者降低。MVD是腫瘤預(yù)后的一個重要指標(biāo)，IDH1突變型患者具有更低的MVD可能是其預(yù)后較好的原因之一。研究也證實IDH1突變的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤增殖指數(shù)(Ki67)及MVD較野生型低，在核磁彌散張量成像(DTI)上表現(xiàn)為更高的最小表觀彌散系數(shù)(ADC)和更低的最大各相異分?jǐn)?shù)值(FA)[15-16]。

膠質(zhì)瘤血管形態(tài)多樣性是其重要的組織學(xué)特點，在生長浸潤過程中以間質(zhì)血管生成為基礎(chǔ)和先導(dǎo)，而VEGF在此過程中發(fā)揮著重要的作用。膠質(zhì)瘤細(xì)胞以旁分泌方式分泌VEGF是促進間質(zhì)血管生成的重要來源。為了明確IDH1突變患者具有更低MVD的原因，筆者構(gòu)建了表達IDH1突變的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。IDH1突變能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[17]；CUI等[18]指出IDH1R132H突變通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路降低細(xì)胞增殖及侵襲能力；而另有研究報道IDH1通過依靠HIF1-α激活核因子κB(NF-κB)參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[19]。為了排除細(xì)胞增殖對VEGF結(jié)果的影響，筆者進行了細(xì)胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)在24 h內(nèi)突變對細(xì)胞增殖無影響(P>0.05)。通過ELISA分析發(fā)現(xiàn)在IDH1突變型細(xì)胞中，VEGF的分泌量較野生型細(xì)胞明顯降低，該結(jié)果與IDH1突變患者具有更低的MVD一致。對膠質(zhì)瘤病例mRNA表達分析發(fā)現(xiàn)，IDH1突變明顯抑制上游調(diào)節(jié)分子HIF1-α及其下游因子VEGF的表達，并且IDH1突變型患者相對腦血容量(relative cerebral blood volume,rCBV)MRI較野生型患者明顯降低，rCBV是一種十分有效的非侵入性評估腫瘤血管生成的方法，表明IDH1突變型患者血管生成能力下降[20]。

綜上所述，IDH1突變導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF分泌降低，血管生成能力下降，MVD減少，這可能是IDH1突變型膠質(zhì)瘤預(yù)后較好的原因之一。但關(guān)于IDH1突變導(dǎo)致VEGF分泌減少及其對放化療敏感的機制還需進一步研究。