宏基因組二代測序在非HIV感染型肺孢子菌肺炎中的應用研究*

陳佳怡，梁 曉，夏銨冬，楊 蕓，袁 兵，耿嘉蔚△

(云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院:1.感染性疾病及肝病科;2.呼吸與危重癥醫學科，昆明 650032)

肺孢子菌肺炎(PJP)是由耶氏肺孢子菌(Pj)感染引起的疾病，常見于艾滋病患者和其他免疫機能低下宿主。近年來隨著免疫抑制藥物的使用，非HIV感染者的PJP越來越引發關注。既往經驗來看，非HIV感染PJP患者往往比HIV感染者發病更急、疾病進展更快、重癥化概率和死亡率更高[1-2]，因此早期診斷尤為重要。在現有臨床Pj檢測手段中，特殊染色鏡檢的病原檢出率低，免疫組織化學和PCR等[3]在多數臨床機構中應用有限。近年來，隨著基因測序技術的發展，宏基因組二代測序(mNGS)在病原學診斷中有越來越多的實踐，多用于特殊、罕見感染的鑒定和新發病原體的解析。本研究報道mNGS輔助診斷非HIV感染型PJP患者情況，結合既往研究闡述mNGS在非HIV感染型PJP病原學診斷中的價值和特點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年4月至2021年1月在本院住院并通過mNGS結合臨床資料診斷PJP的18例患者。入組標準：>18歲；具有免疫受損疾病基礎[4](3個月內有血液系統或實體惡性腫瘤化療史，自身免疫性疾病、器官移植等疾病史及接受糖皮質激素或其他免疫抑制藥物治療>30 d的用藥史，其他免疫功能低下狀態)；肺炎伴呼吸困難、低氧血癥或呼吸衰竭表現；胸部CT提示彌漫型或斑片狀融合型磨玻璃影(GGO)、小葉間隔增厚網格影等間質性病變征象；伴或不伴G試驗、乳酸脫氫酶(LDH)等血清學檢測結果支持；外周血或呼吸道標本mNGS檢出Pj序列；排除HIV感染。本研究通過本院倫理委員會批準(KHLL2022-KY013)。

1.2 方法

1.2.1臨床資料收集

從住院電子病歷系統中收集入選病例的一般資料，包括性別、年齡、入院時間等，以及發病時間、臨床表現、實驗室檢查、影像學檢查、合并癥、傳統呼吸道標本病原檢測結果(涂片+培養等)、二代測序結果、治療及轉歸等臨床資料。抗Pj治療2周以上進行療效判斷，好轉表現為臨床癥狀及生化指標改善，肺CT病灶較前吸收好轉；記錄患者院內死亡情況。

1.2.2mNGS檢測

按照采樣標準流程采集支氣管肺泡灌洗液(BALF) 5 mL或血標本3 mL放置 4 ℃冷藏，并于24 h內專人低溫運送至第三方測序中心(華大基因科技有限公司)。測序平臺使用BGISEQ-500進行測序。數據分析：測序數據下機后去除低質量和長度<35 bp的數據。通過BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對，將人源基因組序列數據去除，再去除低復雜度序列數后與專用微生物大數據庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)比對，按照細菌、真菌、病毒、分枝桿菌和寄生蟲等進行分類和排列。

1.3 統計學處理

采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計數資料以例數或率表示。計量資料以M(P25,P75)表示，兩兩比較采用 Mann-WhitneyU檢驗；測序參數與臨床數據進行Spearman秩相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基本信息

18例患者中男15例，女3例，中位年齡46歲。所有患者均有腫瘤、腎病或自身免疫性疾病背景，見表1。其中16例患者使用激素+免疫抑制劑治療基礎疾病，使用時間10.5(4.0，24.0)個月，另外2例為正在接受化療的惡性腫瘤患者。

表1 18例患者入院時的一般情況及實驗室檢查

續表1 18例患者入院時的一般情況及實驗室檢查

2.2 臨床資料

患者以急性、亞急性起病，從起病至mNGS標本采集的中位時間為16 d，最短4 d。起病癥狀以發熱(77.8%)、咳嗽(100.0%)、干咳(50.0%)、氣促(77.8%)為主。所有患者入院時均有不同程度的低氧血癥，氧合指數(校正大氣壓后)262(215,297)，LDH水平473.0(303.5,581.3)U/L。15例患者的血清1，3-β-D葡聚糖276.0(178.9,569.8)pg/mL，15例患者的誘導痰細胞中性粒細胞比例明顯升高達73.08%～97.02%，提示肺炎癥損傷重。所有患者入院72 h內均進行了細胞免疫功能評估并記錄 CD4+T淋巴細胞計數，其中8例<200個/μL。18例患者均采集呼吸道標本送院內涂片及培養，2號病例痰培養出敏感嗜麥芽窄食單胞菌，7、11、13號病例痰涂片查見真菌孢子和(或)菌絲，但因實驗室條件有限未進一步鑒定，其余均為陰性。影像學上病例均呈現雙肺彌漫性或斑片融合型磨玻璃征，部分可見小葉間隔增厚、網格影、鋪路石征等。

2.3 mNGS結果

測序標本在入院后7～10 d采集，測序結果均于第三方測序中心收到標本約48 h后回報，標本檢出Pj菌種嚴格比對的序列數為14～10 579個，除1例外其余標本的Pj序列相對豐度在85%以上(圖1)，Pj序列數在所有檢出微生物種間排名1～14名(圖2)。不同個體之間的Pj序列數差異較大，與 PJP 的發病時間、氧合指數、CD4+T淋巴細胞計數無明顯相關性(rs=-0.131、-0.129、-0.040，P>0.05)，見表2。Pj序列數在采樣前是否經驗性抗Pj治療(P=0.158)及是否發生院內死亡(P=0.426)的組間比較中也無明顯差異。其他微生物檢出情況：14例患者標本檢出病毒序列，其中，9例檢出人類β皰疹病毒5型(CMV)序列，6例檢出人類γ皰疹病毒4型(EBV)序列，2例檢出了單純皰疹病毒(HSV1)序列，1例血標本檢出了細環病毒屬序列。所有BALF標本都檢出大量細菌序列并報告了可疑致病菌，其中2號病例檢出軍團菌屬，3號病例檢出李斯特菌、銅綠假單胞菌；2例血標本并未檢出細菌序列。

圖1 18例標本Pj序列數及相對豐度

圖2 18例標本Pj序列數在微生物序列中的種間排名

2.4 治療反應及預后

所有患者在采樣前均接受抗菌藥物治療，其中4例患者經驗性使用磺胺甲噁唑/甲氧芐啶或棘白菌素類抗Pj治療，其余患者在mNGS結果回報后加用上述藥物抗Pj治療，部分患者胸部CT特征見圖3。最終3例患者因膿毒癥多器官衰竭而發生院內死亡，其余患者均好轉出院隨訪。

表2 Pj序列數與部分臨床指標的相關性分析

A：2號、4號、12號、15號、16號、18號病例PJP特征表現主要為雙肺彌漫性磨玻璃影，可見網格影和鋪路石征(箭頭)等；B：20號病例抗Pj治療后病灶吸收；C：8號病例從起病局部磨玻璃影(2020-01-23)進展為雙肺彌漫性病變(2020-02-22)，最后抗Pj治療好轉(2020-03-06)。

3 討 論

PJP是免疫抑制宿主常見的嚴重機會性感染疾病，在國內外的報道中，PJP的發病率在侵襲性真菌感染疾病中排名前4[5-6]。早期診斷對PJP患者的預后有重要意義[7]，然而既往臨床實踐中直接獲得PJP病原學證據較為困難，新興的mNGS技術具有高靈敏度、覆蓋廣、無偏倚的特點，給感染病診斷帶來更多的病原信息，且抗菌藥物使用對mNGS的影響小于傳統培養[8]，因此臨床上得以實踐應用。

本研究中主要檢測PJP患者的下呼吸道標本，盡管Pj也可以在人類Ⅰ型肺泡上皮細胞表面定植生長[9]，但免疫正常和免疫抑制人群中的呼吸道病原譜仍有明顯差異。WU等[10]分析了多中心329例重癥肺炎BALF標本的mNGS，Pj序列均在免疫受損的肺炎病例中檢出，而免疫功能正常的264例病例中并未檢出，既往大樣本呼吸道標本mNGS研究中Pj序列檢出率也并不高[8]，提示免疫受損人群的Pj陽性結果有較大意義。此外，有研究觀察到非HIV型PJP BALF中的Pj載量明顯低于HIV型PJP[11]，因此雖然部分標本僅檢出少量Pj序列，本研究仍然將此作為支持診斷的重要依據。

除呼吸道標本外，血液 mNGS在PJP診斷中也有良好的敏感性，且一般不受呼吸道定植菌的干擾。在顧鵬等[12]研究中，外周血mNGS對腎臟病合并PJP的診斷靈敏度和特異度達到了94.59%和100%。另一項研究分析了14例腎移植術后的PJP患者，92.8%的患者均通過外周血或呼吸道標本mNGS發現Pj序列，且與PCR驗證結果一致[13]，值得注意的是，在該研究中呼吸道標本匹配到的Pj序列數(488～29 751)明顯高于血標本(6～260)，并且在2例患者的4份同源同期標本中得到驗證，提示呼吸道標本可能有更高的檢測效能。

此外，非HIV型PJP患者常為免疫機能受損的重癥患者，往往非單一病原體感染。在本研究中，BALF測序都報告了可疑致病菌序列，部分檢測出非典型細菌病原體，如軍團菌屬、李斯特菌等，給治療用藥提供了參考。而2例血標本測序雖然沒有報告細菌序列，但患者的臨床資料均有細菌性肺炎的表現，如咳黃痰、中性粒細胞升高及影像學實變征等，入院后給予經驗性抗菌藥物治療。既往PJP研究中血mNGS的細菌檢出率也僅有21.6%[12]，在另一項重癥肺炎(SCAP)的診斷研究中，以血培養為金標準，外周血mNGS的敏感性和一致率均不如呼吸道標本[14]，提示呼吸道標本對非HIV型PJP的診療更有優勢。

目前對于判斷mNGS檢出序列為致病菌尚無定量標準，有研究提出Pj序列的相對豐度>85%或序列數排名前15名可能提供較滿意的診斷閾值[15]。在本研究中，17例標本中Pj序列相對豐度>85%，包括2例血標本。也有研究觀察到血標本中Pj序列相對豐度差異較大分布離散[12]，由于均為小樣本觀察性研究，還需要更多前瞻性研究來進一步驗證。此外，測序結果不能單一解讀，共識建議[16]若mNGS結果符合患者的臨床表現和其他實驗室檢查，可以根據結果指導臨床決策。

本組病例的誘導痰細胞分類發現中性粒細胞明顯升高，且入院時均有不同程度的低氧血癥或呼吸衰竭，提示患者肺炎癥損傷重。有研究對比了HIV型PJP患者的BALF細胞分類，在非HIV患者中觀察到更高的中性粒細胞計數，間接提示非 HIV型PJP有更嚴重的肺損傷[11]。影像學上，PJP典型的CT特征為雙肺散在斑片樣或彌漫性磨玻璃影、小葉間隔增厚，但不具有特異性。血清G試驗可以輔助診斷PJP，但需要和其他真菌如念珠菌屬、鐮刀菌屬、曲霉菌屬等感染相鑒別。有研究認為下呼吸道標本PCR結合G試驗可以有效地區分PJP定植和感染[17-18]，但G試驗最佳診斷閾值各不相同，需要進一步驗證。此外，mNGS指導抗菌藥物調整后的治療反應也可以作為依據。本研究不足之處在于缺乏特殊染色等驗證試驗，還有部分患者隨訪不足，未能觀察到疾病的遠期變化，未來需要前瞻性研究設計來改進。

綜上所述，在非HIV感染型PJP的診斷中，BALF和血標本mNGS均有較好的靈敏度。非HIV型PJP往往呈現重癥化和混合感染的趨勢，條件允許時仍建議優選下呼吸道標本如BALF送檢，以獲得更全面的病原學信息。此外，Pj序列的相對豐度對致病菌的判定可能有提示作用，Pj序列數與臨床指標及預后無明顯相關，但需要前瞻性更大樣本研究來驗證。mNGS的結果需要綜合其他臨床資料綜合判斷。